PROGRAMMA di CHIMICA BIOLOGICA (o BIOCHIMICA)

(in questa sezione saranno esposti i principali argomenti del programma ricordando che per avere una visione maggiormente dettagliata del corso è consigliabile studiare sui libri di testo opportuni)

Variazioni energetiche nei processi biochimici. Energia libera. Equilibrio e stato stazionario. Flusso dell’energia e composti “ad alta energia”. Reazioni accoppiate. Sistema dell’ATP. Energia libera e potenziale di ossido-riduzione. Interazioni proteine-ligandi. Mioglobina, emoglobina ed immunoglobuline. Catalisi enzimatica. Velocità di reazione. Stati di transizione ed energia di attivazione. Enzimi. Coenzimi, vitamine e metalli essenziali. Cinetica. Equazione di Michaelis-Menten. Calcolo dei parametri cinetici (Vmax ,kcat, Km e kcat/Km) Regolazione intracellulare degli enzimi. Enzimi allosterici: cooperatività e cinetica sigmoidale. Inibizione enzimatica Metabolismo. Aspetti generali e metodi di studio. Glicolisi e fermentazioni. Decarbossilazione ossidativa del piruvato. Ciclo degli acidi tricarbossilici. Catena respiratoria, fosforilazione ossidativa e suo meccanismo. Metabolismo del glicogeno. Gluconeogenesi. Via dei pentoso-fosfati. Cenni sulla regolazione del metabolismo dei carboidrati. Metabolismo dei rigliceridi e degli acidi grassi. Metabolismo degli amminoacidi. Ciclo
dell’urea. Biosintesi delle proteine.

(tratto dall'Università degli studi di Milano - www.unimi.it ) 

MACROMOLECOLE INFORMAZIONALI

LA BIOCHIMICA NEL TEMPO:

-          Pasteouràorganismi viventi e processi

-          1887 Bucheràmostrano la fermentazione in estratti cellulari

-          descrizione della glicolisi

-          descrizione del ciclo di Krebs

-          isolamento di frazioni mitocondriali

-          sequenza amminoacidica di una proteina

-          1953àWatson e Crick: struttura a doppia elica del DNA

-          anni 1960àPerutz: struttura tridimensionale di una proteina

-          codice genetico

-          tecniche di clonaggio di DNA

-          progetto Genoma umano

-          era post-genomica: genomica funzionale

-          proteomica (espressione delle proteine nei singoli tessuti)

1-     struttura chimica dei componenti

2-     interazioni a dare complessi sopramolecolari e strutture complesse

3-     estrazione dell’energia dall’ambiente

4-     mantenimento dell’informazione, suo utilizzo e passaggio alle generazioni successive

5-     crescita, differenziamento, invecchiamento

-          biochimica strutturale

-          studio del metabolismo (vie metaboliche e regolazione)

-          biochimica dell’informazione genetica

-          ricerca medica: patologia, nutrizione, fisiologia

-          farmacologia

-          microbiologia

-          biotecnologie

-          ambiente, ecc

Inoltre sono presenti altri elementi in piccole tracce come: P,S,Ca,Cl,K,Mg,Na,Co,Cu,Fe,Mn,Zn.

-          legami H

-          Forze di Van der Waals

-          Interazioni elettrostatiche

-          Legami non – covalenti

IL LEGAME H:

• Interazione tra un atomo di H legato covalentemente a un gruppo donatore (--OH; =N—H) ed una coppia di e- spaiati di un gruppo accettare (O=C—; =N—)
• Importante l’elettronegatività dell’atomo del gruppo donatore: F(4)>O(3.5)>N(3.0)>C(2.5)>H(2.1)
• Il legame H ha un parziale carattere covalente e l’energia di legame è di ~ 20kJ/mole
• È altamente direzionale (orizzontale, nuclei paralleli, se si presenta qualche angolatura l’energia diminuisce)

-          punto di fusione 0°C

-          punto di ebollizione 100°C

-          densità massima a 4°C = 0.997

-          alta viscosità, tensione superficiale, coesione

-          elevata costante dielettrica (78.54 ~ 80)

-          elevato calore specifico

-          comportamento come solvente: molecole idrofile, idrofobiche, antipatiche

-          forma legami H coi soluti

-          intergaisce elettrostaticamente coi soluti carichi

-          gas polari poco solubili in H₂O (N₂; CO₂; O₂)

-          le molecole non polari tendono ad unirsi per attrazione idrofobia

-          le molecole polari vengono idratate

-          sono importanti se in gran numero

-          energia di legame di ~ 4kJ/mole

-          la distanza tra i 2 nuclei deve essere = alla somma dei raggi di Van der Waals

-          se 2 atomi sono legati covalentemente il raggio è minore

FUNZIONI BIOLOGICHE:

-          trasporto (membrana, ormoni)

-          riserva (piante, cotiledoni, ecc.)

-          contrattili (muscoli)

-          strutturali (struttura cellulare)

-          difesa (anticorpi)

-          regolatrici (ormoni)

Oligopeptidi, polipeptidi, proteine

Gruppi prostetici

-          proteine con funzioni diverse hanno sequenze diverse

-          proteine mutateàmalattie genetiche

-          proteine funzionalmente simile da specie diverse hanno sequenze simili

-          20 – 30% delle proteine umane sono polimorfe

1)      primaria

2)      secondaria

3)      terziaria

4)      quaternaria

-          lunghezze legame e angoli fisse

-          2 atomi non possono avvicinarsi più del raggio di Van der Waals

-          legami non covalenti stabilizzano la struttura (legami H)

-          alfa – elica

-          foglietti – beta

-          destrorsa (dal basso verso l’alto in senso antiorario)

-          3.6 residui per giro

-          13 atomi per giro

-          passo per residuo (distanza tra 2 residui sull’asse): 1.5 A

-          passo per giro: 5.4 A (3.6 * 1.5)

-          rotazione per residuo: 100°

-          unità ripetitiva: 18 residui

-          tenuta insieme da legami H tra l’ossigeno del gruppo carbonilico e l’N del gruppo amminico

-          legami H paralleli all’asse dell’elica

-          carattere dipolare (cariche residue +: NH₂ e cariche residue -: COO)

-          le catene laterali sono all’esterno dell’elica

-          sequenza aa

-          interazioni tra catene laterali degli aa (residui carichi – e residui carichi +) destabilizza

-          forma e dimensioni catene laterali: disturbi

-          interazioni tra catene laterali spaziate di 3 aa o 4 aa (stabile o no a seconda dei R)

-          presenza di residui di PROLINA destabilizza

-          legami H giacciono sul piano del foglietto

-          le catene laterali Ràuna volta sopra e una volta sotto il piano alternativamente

-          filamenti antiparalleli o paralleli

-          nei filamenti antiparalleli possono esserci anse (loop per cambiare direzione) o alcuni gruppi C=O e NH non fanno legame ma interagiscono con l’H₂O

-          nei filamenti antiparalleli i legami H sono lineari; in quelli paralleli sono obliqui

-          elica – loop – elica

-          mano E – F (E – F hand)

-          il Ca⁺⁺ si lega con aa ASP – GLU – gruppo C=O del loop

-          nella proteina a cui è isolata questa strutturaà5° e 6° elica (E e F)

-          struttura a forcina (harpin – structure) con filamenti antiparalleli

-          struttura a chiave greca (filamenti antiparalleli)

-          beta – alfa elica – beta

-          struttura primaria (sequenza aa)

-          struttura secondaria (alfa – elica; beta – sheet; loop)

-          struttura supersecondaria (motivi semplici)

-          struttura terziaria (domini compatti formati da diversi motivi)

-          struttura quaternaria (diversi peptidi con diversi domini che interagiscono tra di loro)

COME PREVEDERE la struttura dalla SEQUENZA:

COME un peptide può assumere  la sua forma 3D: è scritta nella sequenza aa. Se si denatura e poi rigaturaànella sequenza aa c’è l’informazione per raggiungere la forma 3D. La struttura può essere assunta grazie ai legami H, legami ionici, interazioni di Van der Waals.

Una proteina passa dallo stato disordinato ad uno ordinato per cui si ha un aumento di ENTROPIA.

PROTEIN FOLDING:

-          DG =  DH - TDS

-          aumenta l’ordine nella struttura della proteina

-          l’entropia diminuisce

-          quindi occorre DH negativo o un altro aumento di entropia

-          DH è negativo se hanno luogo interazioni favorevoli tra gruppi della proteina: interazioni elettrostatiche (ponti salini, pH); legami H intermolecolari, interazioni di Van der Waals

-          la sfavorevole entropia del folding è compensata dal contributo favorevole dell’entalpia

-          effetto idrofobicoàporta ad un aumento dell’entropia complessiva del sistema(proteina + H₂O)

-          FASE 1: teoria cromosomica dell’eredità

-          FASE 2: basi molecolari dell’eredità

-          FASE 3: decifrazione del codice genetico

-          FASE 4: decifrazione geni e menoma

-          mappe genetiche e fisiche dettagliate

-          individuazione di tutti i geni umani (50 – 100000)

-          sequenziamento completo del menoma umano (3 miliardi di paia di basi o 3000 Mb; Mb=mega base – pair)

-          definizione aspetti etici, sociali e legali

-          mappatura e sequenziamento di organismi modello come E.Coli, Saccaromiches cerevisae, arabidopsis thaliana, C.elegans)

-          investimenti (centinaia di milioni di dollari/anno)

-          costituzione di organismi internazionali

-          chimicaàsequenziamento e sintesi del DNA

-          ingegneriaàsequenziatori automatici, robotica

-          informaticaàbanche dati, algoritmi

-          biologia molecolareàmarcatori molecolari, vettori di clonazione, sistemi di trasformazione

-          22 coppie di cromosomi omologhi più 1 coppia di cromosomi sessuali (X e Y)

-          complessità: 3200Mb (1 Mb = 1 milione di base – pair)

-          30 – 40.000 geni che codificano prodotti proteici

-          dimensioni medie di un gene: 30.000 Bp (base – pair) di cui solo ¹/₅ codificante

-          ¹/₃ del menoma è trascritto

-          solo 1.5% codifica per proteine

La capacità di trasmettere le proprie caratteristiche biologiche risiede ne MATERIALE GENETICO

-          la mitosiàda uno zigote a tutte le cellule e si ha la costanza del DNA in tutte le cellule

-          la meiosiàda una generazione alla successiva e si ha il riassorbimento genetico: gameti ¹

ESPERIMENTO di GRIFFINàvirus R e S

-          polimeri

-          monomeri sono i nucleotidiàbase azotata +  gruppo fosfato + zucchero (ribosio)

-          la base è legata al C1

-          i gruppi fosfato sono in posizione 5 – 3

-          nucleotidiàDNA e RNA

-          NUCLEOSIDEàbase + zucchero (non c’è il fosfato)

-          Il DNA è un eteropolimero

-          Ribosio/desossiribosio = pentosi in cui al C1 si attacca la base; il C2 è la differenza tra ribosio (H) e desossiribosio (OH); il C3 e C5 legano il P

-          anello eterociclico di atomi C e N

-          citosina (DNA – RNA)

-          uracile (RNA)

-          timina (DNA)

-          1 sito di legame tra base e zucchero

-          3 siti di legame tra base e base

-          2 anelli fusi di 5 e 6 elementi

-          adenina: 2 legami H

-          guanina: 3 legami H

-          legame fosfo – diesterico

-          zucchero – fosfato – zuccheroàossatura della catena polinucleotidica

-          3 gruppi fosfato: alfa; beta; gamma

-          il gruppo P alfa si lega al C3 del nucleotide già stato incorporato

-          è presente un nucleotide trifosfato perché occorre energia pre la polimerizzazione e lipera P—P (pirofosfato)

-          il P alfa fa da ponte ai 2 pentosi

-          cristallizzazione del DNA

-          analisi di diffrazione del DNA a raggi X

-          elica destrorsa

-          passo di 3.4 A (1° = 1x10^{-10 m)}

1)      caratteristiche fisiche dell’analisi di rifrazione ai raggi X

2)      regola di Erwin Chagraff: -

-          la quantità delle diverse basi non è fissa (in specie diverse si hanno proporzioni diverse)

-          rapporto purine/pirimidine è sempre ~ =1

-          rapporto A/T e G/C è sempre = 1

-          antiparallela

-          ossatura P—zucchero

-          legami tra basi complementari

-          i legami tra le basi sono legami H

1)      ipotesi meccanismo di replicazione

2)      chiave di lettura sulla natura molecolare dell’informazione genetica

-          sequenza di basi

-          meccanismi di variazione

-          ricadute metodologicheàibridazione molecolare

1)      semiconservativo (no – rottura elica)

2)      conservativo (no – rottura elica)

3)      dispersivo (l’elica si frammenta)

1)      i geni si perpetuano come sequenze di acidi nucleici (DNA o RNA)

2)      la loro funzione è attraverso la produzione di proteine

-          precursoriànucleotidi trifosfato

-          DNA stampo

-          Proteineàenzimi che catalizzano la sintesi

1)      DNA da replicare

2)      Precursori: nucleotidi 3P

3)      ENZIMI di replicazione:

-          dna – polimerasiàsintetizzazano DNA ex-novo; complessi enzimatici grandi; vari tipi; altre attività enzimatiche (controllo)

-          enzimi che mettonola dna – polimerasi in condizioni di operare

-          enzimi che completano l’opera

-          meccanismo molto accurato

-          selezione del materiale

-          svolgimento del DNA

-          sintesi

-          controllo di bozze (senso opposto: da 5’à3’ a 3’à5’)

-          ricadute metodologiche: strumenti di manipolazione (amplificazione,sintesi,clonazione)

-          assorbanza luce UV lunghezza 260nm

-          proteine max assorbenza a 280nm

-          rapporto: O.D. (optical density) 280/260 à< 1.8: più bassa è meglio è

-          da doppia elica a molecola di singola elica (random coil)

-          caloreàaumento di Tàdissociazione delle eliche e più alcali forti

-          temperatura di MELTING (Tm)àpunto di mezzo della T per la denaturazione

-          denaturando il DNA aumenta l’assorbanza

-          non tutti i DNA hanno la stessa Tm perché il legame C—G (C + G) ha + legami H e quindi la Tm è maggiore

-          il DNAàRINATURAZIONE (dipende dalla lunghezza e dalla concentrazione) formazione dei legami tra basi complementari

METODO DI SANGER

SINTESI PROTEICA

RIBOSOMI

-          adattore

-          singola elica a forma di trifoglio per appaiamenti intramolecolari

-          anticodone

-          sito accettare dell’aa in 3’

-          aa legato covalntemente

-          siti della traduzione

-          particelle con rRNA e proteine ribosomiali

-          coefficiente di sedimentazione = SVEDBERG (S) che dipende da massa e forma

-          > massa > tasso di sedimentazione > S

-          alti e lunghi 200 A

-          2 tRNA all’interno

-          la subunità più piccola interagisce con l’mRNA; poi si posiziona la subunità  superiore con 2 siti attivi per la tRNA; la lettura procede da SINISTRA a DESTRA; le 2 subunità si dissociano e si libera l’mRNA che può essere tradotto più volte e poi degradato

-          1 elica di DNA funge da stampo per RNA

-          RNA sintetizzato ha sequenza = alla complementare

-          Elica STAMPOàRNA

-          Elica CODIFICANTEàsequenza = all’RNA prodotto

-          L’enzimaàrna – polimerasi (5’à3’)

-          I tipi di RNAàrRNA; tRNA; mRNA; smRNA (small o piccolo RNA che codifica il segmento d’innesco per la replicazione: il primer)

-          la trascrizione: rna – polimerasi

-          è un complesso enzimatico

-          interagisce con altre proteine detti fattori trascrizionali

-          un tipo di RNA – polimerasiàun tipo di RNA

-          DNA dipendenti

-          Rna – pol 1àrRNA

-          Rna – pol 2àmRNA

-          Rna – pol 3àtRNA e sRNA

-          elica codificante o “senso” (coding strand)àstessa sequenza mRNA 5’p__________OH 3’

-          elica stampo o “antisenso” (template strand)àdirige la sintesi dell’mRNA mediante appaiamento delle basi complementari  3’OH______________p5’

-          mRNAàmolecola stampo per sintesi proteica

-          rapporto lineare mRNA – peptide  5’p_________OH3’ e NH₃---------------COOH

-          più lungo della proteina

-          presenta pezzi che non vengono tradotti

-          NUCLEOTIDE + 1ànucleotide sull’elica codificante che è il 1° NT della sequenza mRNA e costituisce lo STARTPOINT

-          La sequenza prima dello STARTPOINTàregolazione del gene per trascrizione ed è detta PROMOTRICE

-          UPSCREAMàa monte: il promotore

-          DOWNSCREAMàa valle

-          La posizione vicino allo STARTPOINTàPROSSIMALE e man manoàDISTALE

-          In posizione DISTALE a valleàsegnaleàTERMINAZIONE

-          RNA maturo è più corto della sequenza del gene che lo codifica

-          Ibridazione gene – rnaàci si aspetta una doppia elica ma avanzano porzioni lunche a singola elica

-          ESONIàsequenze trascritte e tradotte

-          INTRONIàsequenze tr