PROGRAMMA di BIOLOGIA MOLECOLARE

(in questa sezione saranno esposti i principali argomenti del programma ricordando che per avere una visione maggiormente dettagliata del corso è consigliabile studiare sui libri di testo opportuni)

Analisi delle proprietà chimico-fisiche degli acidi nucleici. Topologia del DNA. Organizzazione primaria, secondaria e di ordine superiore della cromatina. Replicazione del DNA. Forca replicativa, repliconi, enzimi coinvolti nella replicazione del DNA in procarioti e eucarioti. Modelli molecolari di replicazione. Proprietà, sintesi e maturazione degli RNA cellulari.

Trascrizione: Meccanismi molecolari in procarioti e eucarioti. Le RNA polimerasi. Regolazione della trascrizione. Esempi di controllo trascrizionale. Meccanismi molecolari dello splicing. Stabilità degli mRNA. Cenni sui meccanismi molecolari della sintesi proteica.
Esempi di controllo traduzionale dell’espressione genica. Modelli di interazione fra acidi nucleici e proteine e tecniche di indagine relative.
Metodi di analisi molecolare per lo studio dei geni e della loro espressione.

(tratto dall'Università degli studi di Milano, www.unimi.it )

BIOLOGIA MOLECOLARE

Come si pubblica un dato scientifico:

1)      faccio una scoperta

2)      deve avere una rilevanza

3)      decido di pubblicarla

4)      scrivo un manoscritto

5)      invio all’editore che nomina una commissione di esperti (anonimi all’autore) che valuteranno il manoscritto a seconda della qualità e se è “di moda”

6)      i REFEREES (arbitri)àcommentano il manoscritto e decidono se accettare o meno il lavoro

7)      eventualmente si fanno modifiche per migliorare il lavoro per cui i dati sono interpretabili

8)      quando decido di pubblicare devo pagare (4.000 dollari)

9)      scelgo la rivista dell’editore a cui si rivolgono + scienziati

10)  ad ogni rivistaàIMPACT FACTOR (+ alto e + rilevante)

Il biologo si è sempre occupato dei fenomeni naturali ma negli ultimi anni si è specializzato in discipline come la genetica e la biologia molecolare causando una modificazione della Natura con determinate conseguenze.

 SUGARSàpolisaccaridi

ACIDI GRASSIàlipidi

AAàproteine

NUCLEOTIDIàacidi nucleici

È possibile cambiare i gruppi laterali nelle proteine o nel DNA cambiando rispettivamente aa e nucleotidi ma a volte occorre cambiare parte del backbone.

Spesso si osserva la presenza di acidi nucleici e proteine con tecniche di OSSERVAZIOBI INDIRETTE.

PROTEINE:

Proteomaàrete di interazioni tra proteine ed acidi nucleici

Amminoacidiàclassificazione a seconda dei R (gruppi radicalici)

Se si prendono 200 aa (miniproteina) alcuni aa hanno un particolare significatoàDOMINI che fanno interazione.

Bioinformaticaàcapire col computer la sequenza aa

Si può scambiare un aa con un altro ma occorre mantenere le stesse caratteristiche e per far questo tipo di studio si utilizzano le tecniche d’indagine chimico-fisiche e di biologia molecolare. Per cambiare i residui aa bisogna intervenire sul nucleotide che codifica per l’aaàproteina MUTATA.

SI          DEVE           DIMOSTRARE            TUTTO           SPERIMENTALMENTE

Se ho una proteina purificata e misuro la Kmàvalore dimensionale “x”. Quando cambia un aa cambia la Kmàanalisi biochimica ma se cambia la Km non è detto che la cellula cambia.

Devo fare esperimenti in vitro e in vivo.

-         ponti disolfuro –

Sono legami covalenti (S—S) in proteine (es. le immunoglobuline)

L’emoglobina ha 4 catene polipeptidiche uguali 2 a 2 dettate dalle sequenze nucleotidiche

Esperimento 1.

-         proteina purificata

-         denaturazione con calore o 8M urea + mercaptoenolo (riduce S—S ad SH e SH)

-         unfoldingàstruttura 1°

-         messa in condizioni ottimaliàfolding corretto (> parte) MA in alcuni casiàstrutture anomale

-         conclusioni: in cellula ci sono cofattori che “aiutano” a costruire la proteina in pochi istanti. Anche nella cellula avvengono errori ma sono rari e vengono sempre corretti perché una proteina sbagliata può essere tossica. Nella cellula si ha un controllo sulla qualità delle proteine prodotte che le distingue in buone e non buone.

All’interno della sequenza aa esistono piccole sequenze la cui presenza non è importante per la funzionalità della proteina.

PROTEASIà

-         degradano altre proteine

-         riconoscono alcune sequenze di aa

-         endonucleasi

-         se la sequenza bersaglio è “protetta” allora la proteasi non si lega al substrato

Se muto le regioni di una proteina che fungono da substrato per la proteasi allora non contribuisco al folding ma solo al riconoscimento delle proteasi per cui la proteina è comunque ATTIVA.

PURIFICAZIONE PROTEINAà

-         avviene a 4°C

-         ipotizzo di ottenere 2 proteine

-         IPOTESI: interazione tra proteina A e B

Come posso valutare l’interazione?                                                          

      -    posso calcolare una costante di ASSOCIAZIONE:                         

-         con tecniche biochimiche

-         ottengo un numero (può essere buono per la mia dimostrazione) però in vitro queste proteine possono interagire benissimo ma nella cellula potrebbero non vedersi mai oppure possono formare un complesso cellulare ma avere funzioni diverse

Devo dimostrare che non solo l’interazione avviene in cellula ,ma deve anche servire a qualcosa: come lo dimostro?

-         posso produrre mutanti con assenza di queste proteine

-         sistema biologicoàapprocci in vivo e genetici

-         materiale biologicoàottengo qualche risultato da una cellula

La mutazione in A non può essere una lost of function (perdita di funzione) ma cade sul sito di interazione con B (difatti si forma sempre un prodotto)

Questo era un approccio genetico ed ha suggerito una ipotesi e se l’approccio biochimico coincide con quello genetico allora la dimostrazione è + convincente.

Se una colonia bianca diventa rossa allora geneticamente c’è stata una mutazione su un altro gene o all’interno dello stesso.

Questa tecnica si chiama soppressione ad alto numero di copieàsovradosaggio di un geneàsbilancio il contenuto proteico

NUOVA IPOTESI:

-         tra A e B c’è una interazione fisica

-         sappiamo che A viene fosforilata cioè è il substrato di una PK (fosfokinasi, enzimi regolatori che fosforilano solo su certi aa, nei procarioti è + raro)

-         gli aa fosforilati sono SER, THR, TYR

-         la PK riconosce un FOLDING specifico e se c’è una SER la PK la fosforica

-         i residui fosforilati sono preceduti da una PROàcurvaturaàesposizione aa da fosforilare

QUINDI se A è una proteina fosforilata:

Con la fosforilazione la Ser si carica negativamente; è reversibile grazie all’azione delle fosfatasi che hanno meno specificità delle PK che ve ne sono circa 3.000.

DIMOSTRAZIONE:

-         ho un sistema biologico per sviluppi genetici

-         posso fare tutti i mutanti che voglio

-         devo dare dei dati

Non potrei eliminare la Ser32 perché forse è importante strutturalmente MA potrei cambiare la Ser con un aa non fosforilabile per es. l’Ala che ha una carica neutraàno-fosforilazioneàno complessoàcellula bianca (ipotesi 1)

So che con la fosforilazione la Ser acquista una carica negativa allora la sostituisco con un aa carico negativamente, Aspàcellula ROSSA

Devo anche vedere se l’allele mutante Ser32Ala è recessivo o dominante:

Nell’ipotesi in cui la fosforilazione sia inibente allora ottengo cellule rosse (con Ala)àmutazione dominante perché in assenza della kinasi ho potuto bypassare la sua richiesta e ottenere lo stesso cellule rosse con Ser32Ala (in questo ultimo caso non ho utilizzato la kinasi).

La fosforilazione impedisce la formazione del complesso.

Non si riesce quasi mai a trovare una funzione per gli eventi di fosforilazione.

La cellula ha diverse interazioni proteiche nel suo interno senza che abbiano un apparente significato ma la cellula ha un efficiente controllo qualità se si formano errori rilevanti.

IL DNA

NUCLEOSIDEàbase + deossiribosio

NUCLEOTIDEànucleoside + fosfato

BASEàspecificità al sistema ed è il gruppo laterale dell’elica

LEGAME 5’-3’ con stechiometria 1:1:1 (base – zucchero - fosfato)

NUCLEOTIDE TRIFOSFATOàprecursore DNA

MARCARE il DNA:

-         utilizzo il ³²P del gruppo fosfato in posizione a o g

-         a per il DNA

-         b e g vengono idrolizzati e si perdono

SINTESI DNA:

È una reazione poco efficiente per cui posso accoppiare a questa reazione l’IDROLISI del PP (elimino i prodotti). Se aggiungono PPàsi inibisce la reazione di sintesi (in vitro) mentre in cellula si può fare un esperimento farmacologico in cui la pirofosfatasi diventa + efficiente e blocco la sintesi; oppure un approccio genetico in cui il mutante del gene per la pirofosfatasi è reso poco efficiente e la sintesi quindi è meno efficace.

A+G = 1

T+C

Le quantità relative di A/G e T/C variano a seconda delle specie

DOPPIA ELICA:

-         antiparallelaà5’P---3’OH

-         CG (3 legami H) e AT (2 legami H)

-         Molto spesso la cellula la apre

-         Quando la larghezza della doppia elica variaàmutazione

I DIMERI DI TIMINA causano deformazione della doppia elica ma fortunatamente ci sono sistemi di riparazione efficienti altrimenti si avrebbe un accumulo di lesioniàtumori.

La replicazione è molto veloce per cui sono anche maggiori gli errori.

Il DNA esiste in 2 diverse forme:

1)      Z-DNAà+ raro

2)      B-DNAà+ comune, elicoidale

3)      A-RNAàriguarda 2 eliche di RNA ma è stato visto solo in provetta

Il B-DNA presenta un solco maggioreàsi legano proteine associate al DNA e un solco minoreàraramente si legano proteine ma agiscono alcuni farmaci

TOPOLOGIA studia la struttura del DNA.

Nell’analizzare il DNAàvedere, manipolare, analizzare i cromosomi

ELETTROFORESI

-         DNA è carico negativamente e può essere separato in base alla carica

-         Gelatina di agarosioàsi creano delle tasche per il campione

-         O = origine o partenza del gel

-         Applico gli elettrodi e nel tempo il campione migra

Ci sono 2 tipi di elettroforesi:

1)      in base alla massa

2)      in base a forma o ingombro sterico delle molecole

Il DNA migra a seconda della lunghezza: quelli leggeri vanno + lontano verso il polo POSITIVO.

L’ELETTROFORESI:

-         costa poco

-         osservare indirettamente: si aggiunge alla gelatina il colorante specifico (bromuro di etidio) che si intercala nel DNA (quindi è mutageno)àai raggi UVàDNA assume colorazione biancastra

-         la quantità di DNA può essere limitanteàsi ovvia marcandolo in modo radioattivo e si usa una lastra fotograficaàbande nere

-         il pozzetto di partenza si chiama Starting weil

-         è possibile individuare un gene su un cromosoma

-         tutte le bande separate hanno massa diversa e i cromosomi sono lineari

-         le 2 bande sono uguali ma si separano perché la conformazione è diversa

-         il DNA relaxed ha > ingombro sterico, viceversa il supercoiled migra + velocemente.

-         Per capire se la mia digestione è avvenuta misuro le bande e le confronto con uno STANDARD fatto correre in parallelo al mio campione e i frammenti sono a PM noto.

-         Trasferisco i dati su una carta semilogaritmica in cui faccio una retta per valutare la migrazione standard; la distanza è quella tra segmentino e gel, sulla Y metto le paia di basi (bp), interpolo la retta.

Si può separare anche RNA a singolo filamento e i nucleotidi.

I fattori limitanti sono la purezza e la quantità. 

Occorre evitare che una singola molecola di RNA si appaia:

STEMàzona appaiata (o struttura a forcina)

LOOPàzona non appaiata o ansa

Per un ribosoma è + facile leggere un RNA lineare per cui nella cellula si deve prevenire l’appaiamento grazie a delle particolari proteine.

SSBàSingleStrandBindingProteins: strutture proteiche abbinate al DNA.

Per continuare ad aprire la doppia elicaàenzimi specializzati a svitare DNA o RNA (ke appaiato è + stabile) e si chiamano ELICASI.

Come posso vedere l’organizzazione di una molecola di RNA o altro in cellula?

Posso tenere conto del DG degli appaiamenti e si abbinano con una sommatoria, naturalmente tutto ciò lo esegue un computer.

IPOTIZZO quindi un mRNA e posso visualizzare con tecniche appropriate la struttura con i nucleotidi marcati di cui conosco la sequenza.

Posso tagliare RNA con enzimi (RNAasi) e se ci sono regioni protette vuol dire che ci sono siti organizzati e li posso vedere con una elettroforesi.

Dopo aver rilevato che vi è una certa struttura di RNA ci si chiede una cosa molto importante: A COSSA SERVE?QUALE LA SUA FUNZIONE?

Per es. se nell’estremità 5’ ci sono sequenze regolatrici (AUG) e nella zona non trascritta c’è uno STEMLOOPànon trascrive per cui se il ribosoma si attacca a monte dello stemloop si ha la traduzione fino allo stemloop e se si attacca a valleàtraduzione dopo lo stemloop.

TOPOLOGIA DEL DNAà

CROMATINA: interazione tra acidi nucleici e proteine ed è la risposta al problema di come avvolgere il DNA

TOPOSIOMERIZZAZIONEàdiverse strutture dello stesso DNA

RICOMBINAZIONEàriparare lesioni al DNA e permette la variabilità genetica

Se c’è troppa ricombinazione è un segnale di allarme (tumore).

-         ci sono enzimi che trasformano topoisomeri diversi: TOPOISOMERASI

-         se non ci fossero questi enzimi non segregherebbero i cromosomi e non si avrebbe replicazione

-         questi sopra sono i TARGET favoriti dalle topoisomerasi (per i tumori)

-         esistono strutture “cruciforme” o Holiday Junction

Anche nei batteri e batteriofagi è presente il problema di ripiegare il DNA; al centro si nota una matrice poco chiara ove si dipartono delle anse (loop) che si possono attorcigliare.

W = writhing numberàn° di superavvolgimenti (relaxed, W = 0)

L = linking numberàstato topologico molecola di DNA

T = twisting numberàn° di giri dell’elicaà

 L = T + W 

Quasi tutti i riavvolgimenti sono negativi

Per passare da B a C basta aprire B e poi si svolge tutta la struttura, posso denaturare.

Da A a Bàaprire 2 eliche + energia

Da B a Aàsi rompe 1 sola elica e in modo spontaneo l’altra si svolge; nick = rottura del legame fosfodiesterico e si libera energia

CONSIDERAZIONI TERMODINAMICHE:

-         la molecola superavvolta ha maggior energia di quella rilassata

-         il superavvolgimento consente di immagazzinare energia (1 superavvolgimento negativo/200 bpà~9Kcal/mol)

-         l’energia può essere utilizzata per denaturare piccole regioni di DNA (12-50Kcal/mol per denaturazione)

Più efficiente è la purificazione del DNA per l’elettroforesi e più sarò superavvolto

Per passare da supercoiled a relaxedàrompere 1 filamento e l’enzima per andare avanti deve rompere e chiudere la doppia elica

La DNAasi taglia solo per cui non ho intermedi:

1àcontrollo

2-3-4àaggiungo [  ] maggiori di enzima DNAasi

Nelle [DNA] che abbiamo, la DNAasi taglia in punti diversi per cui l’elica è circolare

Nell’altro caso:

Abbiamo prodotti discreti per cui le rotture devono essere saldateàquesti enzimi: NICK & CLOSING e sono TOPOISOMERASI (I) che convertono il DNA supercoiled in DNA meno supercoiled in modo discreto.

Se uso un eccesso di enzima “nick & closing”àtutto rilassato quindi è molto importante la [enzima].

Il bromuro di etidio si va a intercalare nella doppia elica e la deformaàinduce superavvolgimenti positivi senza rompere niente.

Uno sbilanciamento può causare gravissimi problemi alla cellula (mutanti).

Topoisomerasi 2àrompe entrambi i filamentiàavvolgimento da + a -

Toposiomerasi 1àrompe 1 filamento

Sono essenziali per la vitalità della cellula; gli inibitori delle topoisomerasi facilitano il distacco dell’enzima senza far richiudere il DNA.

Come posso capire il ruolo fisiologico di questi enzimi?

-         uso dei mutanti: LIEVITO

-         se elimino i geni TOP2 la cellula muore

Instabilità GENOMICAàaccumulo di mutazioni (traslocazione, inversione, ecc.)

I mutanti possono essere:

-         TEMPERATURA SENSIBILE (T.S.): mutazioni puntiformi che modificano il folding di una proteina per cui assume patogenicità solo a determinate temperature.

-         CONDIZIONALI LETALI: mutanti in un gene essenziale per cui a causa di una condizione ambientale abnorme diventano letali.

Screening di cellule tumoraliàconfronto cellula sana con malate

CROMATINA:

BENDINGàcurvatura del DNA dovuta alla presenza di alcuni legami A—T; può essere NATURALE (o intrinseco) oppure INDOTTO da proteine che legandosi al DNA creano curvature indipendentemente da AT

A cosa serve tutto ciò?

TRASCRIZIONE: nelle vicinanze di un gene c’è una zona regolatrice dove si lega una proteina e inizia la trascrizione (in procarioti, maniera lineare) ma per quanto concerne gli eucarioti, nel DNA “lineare” le regioni sono posizionate a diverse migliaia di basi di distanza e a volte sono anche presenti a valle del gene da trascrivere per cui se la struttura fosse piegata a “bending” le distanze si accorciano. Il BENDING quindi ha importanti implicazioni sulle regolazioni geniche.

Per mappare il centro di curvatura della molecola:

-         possiedo una barra di DNA con all’interno 2 regioni che inducono curvatura

-         mi avvalgo di 2 enzimi di restrizione (1 e 2)

-         separo il DNA in 2 provettine diverse e faccio elettroforesi:

Per sapere se sono importanti queste zone, posso cambiarle con altre basi.

CROMOSOMI EUCARIOTICI:

-         DNA = 2 nm (microscopio elettronico)

-         Cromosoma = 1400 nm (microscopio ottico)

DNAàFIBRA DI CROMATINA: impiccamento del DNA e larghezza di 11 nm

FIBRA DI CROMATINAàSOLENOIDE: collana di perle avvolta in modo + ordinato

Dopo altri 2 passaggi si ha la tipica forma a X del cromosoma. 

La cromatina vista al M.E. presenta una struttura amorfa con dei pallini elettrondensi;

Se le palline fossero di RNAàtratto con RNAasi e se sparisce allora l’RNA è parte integrale;

Con la DNAasi (cromatina + nucleasi)àpalline + sparse QUINDI:

-         le strutture elettrondense non sono DNA

-         il DNA teneva assieme le palline

Infine se tratto con PROTEASI anche la particelle si disgregano.

Da tutto ciò si deduce che la cromatina è la sostanza nucleare fatta di DNA e proteine.

Un altro esperimento consiste nella digestione con nucleari micrococciche in grado di degradare il DNA “nudo” ma non se è mascherato.

Tutto il prodotto ottenuto viene purificato e deproteineizzato e poi seguo elettroforesi e ottengo bande di DNA (so che è DNA dopo che ne ho misurato l’ABS = 260 nm). Le bande sono l’una multiplo dell’altra e ipotizzo un’organizzazione multimerica.

2 ipotesi su come è organizzata la cromatina:

L’esperimento è stato fatto in [  ] non saturanti di DNAasi per cui se è vera la prima ipotesi (1) otterrò un taglio statistico:

Se eccedo con la nuclearià200

-         se è vera l’ipotesi (1) e utilizzo condizioni saturantiàtutto il digerito: 200

-         se è vera l’ipotesi (2) e se uso [  ] diverse di enzima a saturazione si otterrebbe sempre lo stesso risultato

L’ipotesi corretta è la (1):

-         struttura monometrica

-         purificazione degli intermedi di elettroforesi

Devo preparare un GRADIENTEà

-         in una provetta da centrifuga devo creare un gradiente di profondità > sul fondo e leggera sul “top”

-         utilizzo saccarosio o glicerolo

-         uso un formatore di gradiente

-         dopo che ho la mia provetta col saccarosio stratifico il campione, ne introduco pochi ml in soluzione acquosaàinterfaccia visibile

-         centrifuga

-         le particelle sono spinte verso il “bottom” e quelle con densità maggiore migrano + velocemente

-         misuro il coefficiente di sedimentazione (o di Svedberg: S)

-         estraggo le particelle tramite capillare o pompa

-         quello che pesco va in provette seriali

-         dal TOP la densità decresce

-         il tutto è monitorato da uno spettrofotometro (260 nm)

Dentro alla massa di DNA ho trovato del materiale proteico che sono gli ISTONI.

ISTONIà

-         si associano al DNA in modo stabile

-         formano un cilindro

costituiti da 2 H2A + 2 H2B + 2 H3 + 2 H4

CORE:

-         cuore del nucleosoma

-         ottetto istonico: 8 subunità uguali 2 a 2

-         si attorciglia il DNA duplex per ~ 200 bp

H1: istone che non fa parte del “rocchetto” vero e proprio ma è fondamentale

I nucleosomi sono unti da DNA linker

Quando tratto con DNAasi, l’enzima taglia e mangia le estremità, il resto è protetto dalla matrice proteicaàdigestione totale.

La minima regione coperta da istoni è di 146 bp ma occorre una grande quantità di DNAasiàSATURAZIONE.

Quando il DNA si avvolge posso far avvicinare 2 tratti di DNA che erano lontani

H1à

-         funzione rilevante ma che esula dalla funzione del CORE

-         si posizione a lato del ronchetto istonico e stabilizza la struttura

-         se si dissocia dal nucleosoma il DNA è + libero di sciogliersi

Come regolo H1?

1)      se degrado la proteina la devo risintetizzare

2)      se utilizzo una kinasi è un processo reversibile, - dispendioso.

Il nucleosoma è una situazione incompatibile con la segregazione dei cromosomi mentre il cromosoma è una situazione OK per la segregazione ma non per la replicazione.

Cosa avviene se non c’è condensazione completa?

-         se i fusi si formanoàsegregazione anomala

-         se i fusi non si formanoàsistemi di controllo che prevengono attivamente la condensazione

-         se replicazione e condensazione non sono completiàsistemi di controllo (check point) per “frenare” la cellula

Se avviene la segregazione errata:

-         aneuploidie

-         instabilità genomica

-         accumulo di mutazioni

-         cellule tumurali

TECNICHE D'INDAGINE

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LA REPLICAZIONE

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