PROGRAMMA di FARMACOLOGIA MOLECOLARE

(in questa sezione saranno esposti i principali argomenti del programma ricordando che per avere una visione maggiormente dettagliata del corso è consigliabile studiare sui libri di testo opportuni)

Approfondimenti riguardanti la parte di Farmacologia Cellulare.

FARMACOLOGIA MOLECOLARE

ASSORBIMENTO:

-         coefficiente di ripartizione LIPIDI/H₂O

-         liposolubilità

-         superficie

-         [concentrazione]

-         pHà - F acido ha alta capacità ma bassa affinità

                - F basico ha alta affinità ma bassa capacità

                - F acidoà pH acido IONIZZATO/NON IONIZZATO = 0.01 (lume)

                                   pH basico IONIZZATO/NON IONIZZATO = 25.000 (plasma)

BIOEQUIVALENZA:

-         F che hanno uguale cinetica

BIODISPONIBILITA’:

-         dal sito di somministrazione al sito di azione

DISTRIBUZIONE:

-         3 compartimentià ematico (3-4%, pH 7.4, litri = 3); extracellulare (15%, pH 7.4, litri = 9); intracellulare (30-40%, pH 7, litri = 30)

-         I 3 compartimenti sono l’insieme di organi che trattano il farmaco allo stesso modo

-         Vd = (quantità F somministrata)/([plasmatica] misurata)

-         TRAPPINGà accumulo (equilibrio secondo gradiente); sequestro (non equilibrio); tesaurismosi (equilibrio in tempi lunghi)

-         Legame con proteine (albumina)

-         Barriere

METABOLISMO:

-         rende + idrofile le sostanze e ne facilita l’eliminazione

-         reazione FASE 1à redox; idrolisi; idratazione; isomerizzazione; acetilazione

-         reazione FASE 2à coniugazione

-         P₄₅₀à sistema microsomiale epatico ubiquitario; inibito da C=O; avvengono reazioni di redox, coniugazione, ac. Glicuronico.

ELIMINAZIONE:

-         rene, fegato

-         cinetica di 1° ordineà X-10% = Y-10% = Z-10%....

-         cinetica di 0° ordineà eliminazione quantità costante

-         CLEARANCE: è un volume ed è uguale a Kc-Vd

-         Circolo enteroepatico: la flora intestinale con coniugazione permette il riassorbimento del farmaco.

RECETTORI:

-         F lega R e altera la funzione

-         Binding

DOWN REGULATIONà

-         desensitizzazione

-         omologa: diminuisce solo il segnale del R stimolato

-         eterologa: recettori per diversi ligandi diminuiscono tutti per stimolo di uno solo

UP REGULATION: fenomeno inverso al precedente

AFFINITA’:

-         potenza R + X ↔ RX     Ka = [RX]/[R][X] = affinità

-         1/Kd (pendenza)

Bmax:

-         densità dei siti (intercetta)

-         numero massimo di ligandi che lega / cellula

LIGANDO e R:

-         complementari

-         la specificità dipende dalla []

 DOSE-EFFETTO / DOSE-LEGAME

AGONISTA PURO: effetto massimo, non diminuito da antagonista competitivo

AGONISTA PARZIALE: effetto massimo diminuito da agonista competitivo

AGONISTA INVERSO: segnale opposto all’agonista puro

ANTAGONISTA PURO: non attiva il segnale

-         REVERSIBILE: aumentando l’agonista lo si supera (= effetto massimo)

-         IRREVERSIBILE: non lo si supera e l’effetto massimo cala

-         COMPETITIVO: superato aumentando agonista puro

-         NON COMPETITIVO: non superabile anche aumentando agonista puro

AGONISTA ANTAGONISTA: su 2 recettori diversi

EFFETTO DOSE-RISPOSTA:

-         pendenzaà maneggevolezza del farmaco e n° di R usati per ottenere l’effetto

-         posizioneà potenza del F

-         plateuà effetto massimo, non correlato alla potenza

-         variabilitàà dipende dal F e dall’individuo

-         ED₅₀à dose efficace 50%      (IN VIVO)

-         DL₅₀à dose letale 50%          (IN VIVO)

-         TD₅₀à dose tossica 50%        (IN VIVO)

-          EC₅₀à [] efficace 50 %         (IN VITRO)

-         CL₅₀à [] letale 50%               (IN VITRO)

-         TC₅₀à [] tossica 50%            (IN VITRO)

-         INDICE TERAPEUTICO = TD₅₀/ED₅₀ = TC₅₀/EC₅₀; più è piccolo e più è tossico

-         Iperreattivitàà effetto a dose inefficace

-         Iporeattivitàà nessun effetto a dosi alte

-         Ipersensibilitàà allergia

-         Idiosincrasiaà effetti rari

-         Tolleranzaà la risposta a dosi successive dello stesso F diminuisce ma viene ripristinata aumentando la dose

-         Tachifilassià come sopra (tolleranza) ma non può essere ripristinata aumentando la dose

NEUROTRASMETTITORI:

-         in base al recettore à ionotropi; metabotropi

-         in base alla chimicaà aaminoacidi; ammine; peptici

-         in base alle funzionià neuro-trasmettitori/ormoni/modulatori/mediatori

CATECOLAMINE (prima parte):

-         DOPAMINA (DA)

-         NORADRENALINA (NA)

-         ADRENALINA (A)

Sintesi di A:

Metabolismo di A:

-         se aumenta ma concentrazione di Ca⁺⁺ à release

-         OUABAINAà blocca la ricaptazione

Catabolismo delle CATECOLAMINE:

MAO:

-         enzimi mitocondriali pre- e post-sinaptici

-         intervengono nel metabolismo delle catecolamine

-         MAO_Aà (5-HT) soprattutto in neuroni catecolaminergici; agenti bloccanti sono il Toloxolone e Broforamina

-         MAO_Bà (DA, NA) in neuroni serotoninergici; agenti bloccanti sono la Selegina (deprenyl)

COMT:

-         enzimi post-sinaptici à O-metilazione delle catecolamine

-         agenti bloccanti sono il Talcopone

PATOLOGIE:

-         Parkinsonà perdita cellule della substanzia nigra (DA)à rigidità, prevalenza Ach

-         Corea di H. à maggior DA nello striatale

-         Discinesia tardivaà aumentano i recettori DA

-         Memoriaà migliorata da β-agonisti

DOPAMINA (DA)

RECETTORI:

-         D₁à nigra, accumbens, amigdala

-         D₂à striato, chemocettore, glomi carotidei

-         D₃; D₄; D₅

FARMACOLOGIA (DA):

-         tossicià 6-OHDA e MPTP

PRECURSORI:

-         L-DOPA (influenza anche 5-htp); cibi con aa, fattori che influenzano ABS (assorbimento)

INIBITORI:

-         della THàαmpT

-         DCC: carbidopa

FALSI TRASMETTITORIàα-metilDOPA

BLOCCANTI CATABOLISMO:

-         anti MAO_B: selegina (deprenyl)

-         anti COMT: talcopone

AGONISTI:

-         direttià apomorfina

-         indirettiàamfetamina

ANTAGONISTI:

-         D₂ > D₁ à tioxantine; fenotiazine

-         D₁/D₂/D₄ à clazopina

-         Usati come antipsicotici

INIBITORI STORAGE: resurpinaà non captazione in granuli

BLOCCO RICAPTAZIONE: benzotropina, amfetamina, cocaina

NORADRENALINA (NA)

RECETTORI:

-         α₁à vasi cerebrali

-         α₂à tronco cerebrale (veglia, sedazione)

-         β₁à cuore, rene (maggior contrazione, ritmo cardiaco)

-         β₂àcervelletto, corteccia, bronchi

FARMACOLOGIA:

-         tossici: 6-OHDA

-         precursori: L-DOPA; DOPSàdecarbossilato a NA

-         inibitori: blocco aspecifico di TH e DDC; blocco specifico di DOPA- β-idrossilasi; Disulfiram

-         falsi trasmettitori: α-metilDOPA

-         inibitori storage: reserpina

-         liberatori NA: amfetamina, cocaina

-         inibitori catabolismo: anti MAO_Aà toloxatone, moclobemide; anti COMTà Talcopone

-         bloccanti ricaptazione: antidepressivi triciclici (amine 2°)

AGONISTI:

-         clonidina α₂

-         dobutamina β₁

-         terbutalina β₂

ANTAGONISTI:

-         prazosin α₁

-         yohimibina α₂

-         tumalolo β₁

CATECOLAMINE (seconda parte)

-         stimolazione muscolatura liscia, vasale e ghiandolare

-         inibizione muscolatura liscia, bronchiale, intestinale

-         eccitazione cardiaca

-         aumento di acidi grassi

-         effetti endocrini

-         regolazione cibo, stimolo respiro e attività motoria (SNC)

-         effetti presimpatici di stimolo e inibizione

AGONISTI:

-         direttià mantengono l’effetto dopo denervazione

-         indirettià perdono o diminuiscono l’effetto dopo denervazione

FALSI TRASMETTITORIàeffetti minori dei trasmettitori originali

RECETTORI:

RECETTORI α:

-         α₁à vasocostrizione, midriasi, aumento pressione sanguigna

-         α₂à inibizione liberazione NA, presinaptici

-         cute, costringe muscolo

-         antagonistaà ergotamina

RECETTORI β:

-         β₁à tachicardia, aumento contrattilità miocardia, sul cuore

-         β₂à vasodilatazione, broncodilatazione, rilassamento muscolatura liscia utero

-         antagonistaàisoproterenolo

ADRENALINA (A):

-         α e β

-         stimolo aumenta la pressione arteriosa, aumenta frequenza, vasocostrizione

-         anti α à tutto scende

-         anti β à tutto sale

-         aumento renina (β₁)

-         stimolo cuore (β₁)

-         rilascia i bronchi (β)

-         aumenta glucosio, diminuisce insulina (α₂) e > insulina (β₂), aumenta glucagone

-         midriasi

NORADRENALINA (NA):

-         trasmettitore post-ganglionico

-         identico ad adrenalina per effetti su recettori β₁, mentre differisce per α /β₂

-         aumenta la pressione arteriosa perché è vasocostrittore

-         metabolismo come A

DOPAMINA (DA):

-         a basse [ ]à agisce su D₁ e dilata

-         ad alte [ ] à agisce su β₁ e aumenta la pressione arteriosa

-         ad altissime [ ] à agisce su α₁ e crea vasocostrizione

BETA-AGONISTI:

-         in broncocostrizione e scompenso

-         adrenalina, efedrina

-         isoproteneroloàagonista β₁/ β₂, poco α (asma); diminuisce resistenze periferiche vascolari e aumenta la gittata; rilascia tutti i muscoli lisci

BETA-2 AGONISTI (β₂):

-         va bene in asma

-         albuetrolo (resistente a COMT); formoterolo

-         possono stimolare cuore, tremori muscolari, tachicardia

BETA-ANTAGONISTI:

-         propanololo: β₁/ β₂; in ipertensione e aritmia

-         labetalolo: α e β antagonista; peggiora l’asma

BETA-1 ANTAGONISTI (β₁):

-         cardioselettivi

-         atenololo, acebutolo (antiipertensivi): peggiorano scompensi, asma con attenzione

ALFA-1 AGONISTI (α₁):

-         muscolatura liscia

-         metossamina, fenilefrina (contrazione arteriosa), metildopa

ALFA-2 AGONISTI (α₂):

-         clonidina (antiipertensivo)

-         αmetilNA: falso antiipertensivo

ALFA-ANTAGONISTI (α):

-         anti α₁à vasodilatano

-         anti α₂à liberano NA e Ach

-         blocco α₁ nel cuoreà diminuisce la pressione arteriosa e blocca la vasocostrizione

-         blocco α₂ nel cuoreà aumenta NA liberata dalle presinapsi

-         prazosin: α₁ specifico

-         usati in ipertensione, scompenso, ipertrofia prostatica

SEROTONINA (5-HT):

-         sintesi:

RECETTORI:

-         5-HT₁: sistema libico e midollo

-         5-HT_1-A: ippocampo, amigdala, cibo, memoria, aggressività, depressione

-         5-HT_1-B: striato

-         5-HT_1-C: nigra, ipotalamo, diminuisce locomozione e cibo

-         5-HT_1-D: surrenali

-         5-HT₂: post-sinaptici, lega NA, Ach, DA, 5-HT; situati in corteccia frontale, ippocampo; schizofrenia

-         5-HT₃: canale ionico, rapida depolarizzazione, antiemetici

-         5-HT₄: cavie e topo

FISIOLOGIA: modula sonno, cibo, dolore, aggressività, sesso, ansia

FARMACOLOGIA:

-         tossicià 5,6-DHT e 5,7-DHT che ledono i neuroni

-         inibitori sintesià PCPA (inibitore TRP-OH), carbidopa (inibitore decarbossilasi)

-         inibitori catabolismoà anti MAO_A sono il toloxatone, brofaromina

-         inibitori ricaptazioneà imipramina, antidepressivi

-         bloccanti storageà reserpina

-         AGONISTIà m-CCP, sumatriptan

-         ANTAGONISTIà ansiolitici, antipsciotici, antiemetici, metergolina

MELATONINA:

-         diminuisce con la luce

-         regola ritmi circadiani

-         sintesi nella ghiandola pineale

IPERTENSIONE:

FARMACOLOGIAà

-         diuretici: ritengono il Na e diminuiscono il volume ma poi si torna allo stato iniziale

-         bloccanti gangliari: bloccano i recettori nicotinici

-         bloccanti neuroni catecolaminergici

-         reserpina

-         vasodilatatori

-         agonisti α₂ centrali

-         antagonisti α₁ periferici

-         β-boccanti

-         bloccanti canale Ca⁺⁺

-         bloccante ACE: blocco bradichinica e angiotensina-1à2

PARKINSON:

-         alterazione del controllo del movimento

-         degenerazione della sostanza nigra

-         L-DOPA

-         Carenza 80-90% di DA, coinvolge recettori D₁ e D₂

-         Posso bloccare l’Ach (acetilcolina)

Meccanismo d’azioneàaumento DA e aumento effetto su D₂

-         effetti collaterali: fenomeni “ON-OFF”àimprovvisa non risposta alla terapia; fenomeni     “FINE DOSE”àverso fine terapia inizia il tremore

L-DOPA + carbidopa:

- raggiunge meglio il cervello

- inibizione DDCàpotenziamento COMT; 3-O-metilDOPAàcompete per il passaggio della BEE

- L-DOPA + carbidopa(blocca AAAD) + talcopone(blocca COMT)à L-DOPA al cervello

- inibitori MAO_B

AGONISTI dopaminergici: bromocriptinaàantagonista D₁/D₂ usata in ON-OFF

ANTICOLINERGICIàantimuscarinici

ANTIISTAMINICIàeffetto antimuscarinico

GABA:

-         modula attività dopaminergica a livello della sostanza nigra

-         benzodiazepine sono gabaergici

COREA DI HUNTINGTON:

-         operatività DAergica

-         GABA e Ach

-         Deplezione catecolaminergica con reserpina

NEUROLETTICI:

-         per la schizofrenia

FARMACI:

-         antidopaminergici D₂

-         migliorare il rapporto con la realtà

-         clozapinaàpuò presentare sintomi Parkinson-simili

-         aspecifici

FARMACOCINETICA:

-         legati a proteine

-         coniugati a livello epatico

-         scelta del F per tentativi

-         sicurezza alta (da soli)

-         passano la barriera placentare e possono trovarsi nel latte materno

EFFETTI COLLATERALI:

-         endocrini, neurologici (sedazione, stanchezza)

-         ipotensione, ittero

-         discrasie ematiche, dermatiti

-         discinesia tardiva (rigidità muscolare nei movimenti) dovuti agli antiDOPA

-         antiemetici

-         eucinetici

-         sedativi

INFIAMMAZIONE:

-         risposta spontanea aspecifica (innata)

-         risposta immunitaria specifica

-         calore, dolore, rossore, alterazione funzione

-         dilatazione arterialeàaumenta capillarità venule post-capillari (edema)

-         componente umorale e cellulareàcellule polimorfonucleate e mononucleate migrano al sito d’infiammazione

3 FASI:

A) acuta transitoriaàvasodilatazione (COX1 > COX2)

B) tardivaàleucociti e fagociti

C) cronica proliferativiàdegenerazione e fibrosi (COX2 > COX1)

Le PG (ProstaGlandine) aumentano l’infiammazioneàuso F che bloccano PG

MEDIATORI dell’INFIAMMAZIONE: istamina, bradichinica, citochine

FARMACI ANTIINFIAMMATORI:

FANS (Farmaci Antinfiammatori Non Steroidei):

-         interferiscono con il catabolismo dell’acido arachidonico

-         antinfiammatori

-         antipiretici

-         analgesici (anti COX1)

Occorre ottenere acido arachidonico dai lipidi di membrana.

STEROIDIàblocco della fosfatidilserina

MECCANISMO D’AZIONE:

-         blocco delle COX

-         blocco sintesi PGG₂

-         blocco attività perossidasica

-         prevenzione malattie cardiovascolari

-         potenzia i LEUCOTRIENI (rischioso con l’asma)

COX-1àsempre presenti

COX-2àinducibile da citochine

Se prendo un anti-COX1 (aspirina) e poi un anti-COX2 (aulin) à peggioramento

INIBITORI COX-2 vanno bene insieme alle terapie per:

-         neoplasie

-         neurodegenaritve

-         iperalgesia

-         infezioni CHV

Causano però altri effetti quali:

-         vasocostrizione renale

-         blocco produzione muco gastrico

-         blocco aggregazione piastrinica

PARACETAMOLO:

-         analgesico

-         antipiretico

-         agisce centralmente

-         rapidamente ossidato

METABOLISMO DEI FARMACI: (approfondimento)

ELIMINAZIONE:

-         lipofiloàidrofilo

-         escrezione (urinaria, biliare, respiratoria, fecale, traspirazione)

-         processo contrario all’assorbimento

-         BIOTRASFORMAZIONEàF da lipofilo ad idrofilo tramite enzimi metabolici

METABOLISMO:

-         la [F] vicino al R = INFLUSSO (assorbimento e distribuzione) – EFFLUSSO (metabolismo, escrezione)

-         F liposolubile entra nella celluleàenzimiàtrasformazione; eccezione per la suramina (antitripanosoma) rimane in circolo per 2-3 mesi

-         Origine a metaboliti poco attivi e facilmente escretabili

-         Origine a metaboliti più attivi o tossici (eroinaàmorfina; metabolica ossidato del paracetamolo)

-         BIATTIVAZIONE dei profarmaci (L-DOPAàdopamina)

SITI ANATOMICI:

-         determinati dalla distribuzione del F nel corpo

-         organi specializzati come FEGATO (effetto di 1° passaggio), polmoni, placenta, flora intestinale

FEGATO:

-         passa il sangue refluo

-         sistema enzimatico: citocromo P₄₅₀ à complesso enzimatico nei MICROSOMI (artefatti)

-         MICROSOMI: ruvidi (costituiti da RER) e lisci (REL, GOLGI, mitocondri, membrana cellulare). Sono di natura lipoproteica e quelli lisci sono il sito di biotrasformazione; qui i F lipofili diventano idrosolubili mentre quelli meno lipofili vengono metabolizzati da enzimi citoplasmatici

CITOCROMO P₄₅₀:

-         gruppo prostetico Fe⁺² (red) ↔ Fe⁺³ (ox)

-         ubiquitario

-         un F: R-HàR-OH (più idrofilo e escretabile)

-         il Fe media il ciclo di ossidoriduzione e delle 2 molecole di O₂ introdotte, una esco con H₂O e una è introdotta nel F

-         isoenzimi

BIOTRASFORMAZIONI

-         reazioni enzimatiche

-         FASE-1à non sintetiche o di funzionalizzazione

-         FASE-2 à sintetiche o di coniugazione

REAZIONI NON SINTETICHE (FASE-1):

-         modificazione porzione essenziale della molecola

-         ossidazioni, riduzioni, idrolisi

-         possono essere mitocondriali (non microsomali)

-         microsomaliàenzimi per il trasporto di elettroni o enzimi associati al RE

OSSIDAZIONE di molecola da parte del citP₄₅₀

-         O₂; NADPH e suo enzima; citP₄₅₀

-         Esiste un P₄₅₀ extraepatico

-         Ossidasi citosolicheà nella porzione solubile del fegato, reni, polmoni

-         Ossidazioni delle purine

-         Ossidazioni mitocondriali (nei mitocondri)àdeaminazione ossidativi (MAO per le catecolamine endogene)

RIDUZIONI e IDROLISI

-         inibite da O₂

-         NADPH

-         Enzimi microsomali e non-microsomali

-         Azotoriduzioni:

R-N≡N-R’ à  R-NH₂ + R’-NH₂

      -    Nitroriduzioni:

-         IDROLISIàesterasi plasmatiche: acetilcolinaècolina + acido acetico

-         Queste reazioni diminuiscono dimensione della molecola e donano gruppi funzionali (OH, NH₂, COOH) per la successiva FASE-2

REAZIONI SINTETICHE (FASE-2):

-         rendono il F più idrosolubile

CONIUGAZIONI:

-         composto legato a molecola endogena à coniugato:

-         più solubile in acqua

-         più ionizzato

-         passaggio difficoltoso tra membrane

-         sono reazioni microsomali e non-microsomali

-         TRANSFERASI

-         Occorre energia per attivare cofattori intermedi ad alta energia

-         Legami covalenti

GLUCURONAZIONE:

-         reazione microsomale

-         substrati su cui agiscono questi enzimi sono (alcoli, fenoli, acidi carbossilici, amine, tioli, sulfonamidi)

-         elevato numero di cofattori coinvolti

-         acido uridindifosfoglicuronico

-         enzima: UDPGA-TRANSFERASI

-         forte idrofilicità alla molecola per la presenza di numerosi –OH

-         UDPGAàmetabolismo sintesi glicogeno

-         I prodotti della glucuronazioneàsubstrato per le β-glucuronidasi nella flora intestinale

SULFATAZIONI:

-         cofattoreà PAPS = 3’-fosfoadenosin 5’-fosfosolfato

-         enzima: sulfotransferasi

METILAZIONI:

-         diminuisce la idrosolubilità

ACETILAZIONI:

-         cofattoreàAcetilCoA

-         acetil-derivati meno idrosolubili dei F originali

-         sulfamidiciàprecipitano nei tubuli renaliàdanno renale

CONIUGAZIONE CON AA:

-         glutatione (antiossidante, tripeptide gly-glu-cys), protettivo; in citosol e microsomi

-         glicina

-         glutammica (uomo)

-         ornitina (uccelli)

-         formazione acido mercapturico

FATTORI CHE INFLUENZANO IL METABOLISMO:

-         età

-         dieta

-         fumo

-         malattie

-         farmaci (interazioni)

-         T corporea

ETA’:

-         capacità metabolizzante bassa in vecchiaia e nascita (diversa attività metabolica e quantità)

-         neonato possiede 5% del P₄₅₀ dell’adulto

-         Hb fetaleàbilirubina (fotosensibile)àkernittero

-         Poca coniugazione / glucuronazione

-         Cloramfenicoloàsindrome del “bambino grigio”

DIFFERENZA TRA SPECIE:

-         metabolismo ossidativi dell’esobarbital varia da specie a specie (uomo < cane)

-         imipramina (antidepressivo)àagisce demetilatoàOK nel ratto ma NO nel coniglio

-         glucuronazione deficitaria nel gatto

-         differenze dovuta a velocità e tipo di vie metaboliche

-         utilizzare modelli che dal punto di vista biotrasformativo siano più simili al target biologico

DIFFERENZE INTRASPECIFICHE – FATTORI GENETICI:

-         polimorfismo

-         rispetto allo stesso dosaggio si possono avere reazioni diverse

-         acetilazioni veloci o lente à dosi diverse

-         diversa glucuronazione tra razza bianca e gialla per il paracetamolo

DIETA:

-         mancanza di minerali (Ca, Cu, Fe, Zn) à minor efficienza ossidativa

-         mancanza di vitamine (C, E, complesso B) à minor velocità di biotrasformazione

-         presenza di sostanze non-nutrienti (composti indolici, rottura aa) à aumento P₄₅₀1A

-         TEMPERATURA CORPOREA:

-         - se alta à aumenta metabolizzazione à stati febbrili

ORMONI – SESSO

-         femmine di ratto: metabolizzano più lentamente dei maschi per cui occorre diminuire la dose dei barbiturici

FATTORI GENETICI:

-         colinesterasi plasmatiche: degradazione succinilcolina

-         N-acetil transferasi: coniugazione isoniazide

FATTORI PATOLOGICI:

-         cirrosi

-         epatite

-         epatoma

-         diminuiscono capacità di metabolizzare del fegato

FUMO:

-         contiene benzopirene

-         fumo da tabaccoàprodotti di pirolisi

-         fumo di vegetaliàinduttori del metabolismo, della biotrasformazione (idrocarburi policiclici)

FATTORI AMBIENTALI:

-         metalli pesanti (Pb, Hg, Cd)

-         inquinanti industriali

-         possono essere sia induttori che inibitori.

FARMACIàstimolare o inibire il metabolismo di se stessi e altri F con medesime vie metaboliche

STIMOLANTI:

-         barbiturici

-         fnilidantaine

-         mepobromato

-         alcool

-         cloroformio

-         tranquillanti

-         additivi

-         insetticidi

-         aumentano attività enzimatica e la quantità di enzimi

-         l’induzione è reversibile (finisce interrompendo l’assunzione del F)

-         induzione di P₄₅₀ e altri enzimi e sintesi proteica (inibitori sintesi proteica bloccano questa induzione)

-         l’aumento di metabolismo si ha per tutti i F che attraversano una precisa via metabolica

-         barbituriciàtolleranza metabolica: somministrando la stessa dose nel tempo diminuisce l’effetto, il F viene sempre più metabolizzato e allontanato

-         sostanze cancerogene sono: TCDD (TetraCloroparaDibenzoDiossina), benzopirene, 3-metilcalantrene

-         a livello citoplasmatico: proteina recettoreàtrasloca nel nucleoàtrascrizione geni P₄₅₀

-         barbiturici modulano attività trascrizionale, aumentano la produzione di mRNA ed enzimi microsomali

-         etanolo e composti a basso peso molecolareàrallentano turn-over degli enzimi (che permangono più a lungo nella cellula)

INIBITORI:

-         per avere + a lungo il F

-         SKF525A (proadifen) inibisce molte reazioni catalizzate dal P₄₅₀

-         Il legame è reversibile

-         Proadifen + barbiturici (esobarbital)àprolungamento azione ipnotica

-         Prevenzione epatotossicità dovuta a metaboliti tossici di un F

ELIMINAZIONE

VIE DI ESCREZIONE:

-         movimento retrogradoàF dai tessutiàcircoloàorgani/tessuti che separano ambiente interno-esterno

-         renale

-         epatica-intestinale

-         polmonare

-         cutaneo-mucosa

-         ghiandola mammaria

RENE:

1)      arterie ampie e brevi con elevata pressione idrostatica (è vicino al cuore)

2)      arterie piccole

3)      arteriose afferenti (capsula di Bowmann)

4)      capillari glomerulari: endotelio con larghi pori per passaggio sostanze grazie a pressione idrostatica

5)      dai capillari glomerulariàultrafiltrato: rapido movimento plasmaàcapsula

-         flusso ematico elevato: 1.3 litri/min; 25% gittata cardiacaà20% ultrafiltrato a livello glomerulare e di questo 20%, 150 litri/gg di volume plasmatici e di questi 150 litri, 130 ml/min

-          assorbe l’acqua

-         F se in forma liberaàultrafiltratoàincanalato nel tubulo prossimale

-         F se carico NON viene riassorbitoàno-passaggio retrogradoàfacilmente eliminabili

-         F se NON carico e LIPOFILOàriassorbito

TUBULO DITSALE:

-         F liofiloà viene riassorbito

-         F idrofiloà probabilmente riassorbito

-         F caricoà non viene riassorbito

TUBULO PROSSIMALE:

-         F liofiloàviene riassorbito

-         F idrofiloà probabilmente riassorbito

-         F caricoà non viene riassorbito

ANSA DI HENLE

1)      il F libero entra nel filtrato glomerulare

2)      secrezione attiva (acidi + basi deboli); i sistemi di trasporto (uno per il F basico ed uno per il F acido) hanno bassa specificità; i carriers possono trasportare sia composti endogeni che Fàcompetizione (probenecid VS penicillina: il primo si lega al trasportatore e la penicillina permane + a lungo)

3)      riassorbimento passivo del F non ionizzato e liposolubile

-         nel passaggio tubulareà99% dell’acqua è riassorbita e F si concentra: se è liofilo viene riassorbito mentre se è idrofilo viene escreto

-         via via che si forma urinaàacidificazione (ph = 5-6.5)

-         F acidi deboli (barbiturici) nella forma indissociata vengono riassorbiti

-         Se si basificano le urine con bicarbonatoàescrezione

-         Urina contiene F ionizzato non liposolubile (non riassorbito)

F può essere:

-         filtrato

-         filtrato e parzialmente riassorbito

-         attivamente secreto nei tubuli

ESCREZIONE = (FILTRAZIONE + SECREZIONE) – (RIASSORBIMENTO)

ESCREZIONE EPATICA:

Secrezione biliareà4 sistemi di trasporto:

-         per sostanze neutre

-         per anioni

-         per acidi biliari

-         per cationi

Un litro di bile al giorno è:

-         metabolizzata dalla flora intestinale

-         riassorbita

-         eliminata con le feci

ALTRE VIE DI ESCREZIONE:

1)      BILIARE

-         1 litro/gg

-         Fegato elimina sostanze con peso molecolare minore di 300Da

2)      POLMONARE: sostanze gassose e liquidi volatili

3)      CUTE: traspirazioneàquote modeste di F

4)      LATTE

-         diffusione semplice della forma non carica

-         pH più acido del sangue per cui i F basici sono ionizzati ed escreti

ESCREZIONE ATTRAVERSO RENE:

-         nefrone: unità funzionale

-         corteccia

-         midollare

-         VOLEMIAàmantenere costante il volume del sangue

-         Regola gradiente di pressione osmotica tra sangue e tessuti

-         Aggiusta la [  ] assoluta e relativa dei costituenti plasmatici

NEFRONE:

-         unità funzionale costituita da tubuli e capillari

-         dei 150 litri/gg che passano nel reneà1.5 litri: urina/gg

-         1.000.000/rene

-         Epitelio monostratificato

FUNZIONAMENTO:

-         filtrazione poco selettiva di grossi volumi di plasma

-         riassorbimento più selettivo del 99% di acqua filtrata e parte dei soluti

-         secrezione attiva tubulare di acidi e basi dal plasma al lume tubulare

-         a livello della capsula di Bowmann si forma l’ultrafiltrato ed i metaboliti e F fuoriescono

-         ultrafiltrazione glomerulare (molecole < 50kDa)ànon passano proteine e F legati ad esse

-         diffusione passiva secondo gradienteàtubulo prossimale e distale (F lipofilo riassorbito)

-         trasporto con carriersàper sostanze acide (penicillina, aspirina, sostanze glucunorate) e per sostanze basiche (istamina, serotonina)

FARMACOCINETICA (approfondimento)

FARMACOàsostanza biologicamente attiva e deve raggiungere il sito d’azione

Il F a livello ematico va incontro a:

-         assorbimento

-         distribuzione

-         metabolismo

-         eliminazione

FASI DI AZIONE: applicazioneàbiodisponibilità(A)DMEàfarmacodinamicaàeffetto

Vie di SOMMINISTRAZIONE:

-         entrale

-         parenterale

-         varia

ASSORBIMENTO

-         F solidoà(Ki)àF soluzione

-         Forma farmaceutica

Membrane biologiche:

• pKa; lipofilia
• diffusione passiva
• diffusione acquosa
• diffusione facilitata
• trasporto attivo
• endocitosi

-         modulato da cibi

-         ionizzazione importante nella somministrazione gastrointestinale (cibi, farmaci, patologie)

-         nella somministrazione per OSàEFFETTO DI 1° PASSAGGIO: F nel circolo enteroepatico dove viene metabolizzato e/o escreto per via biliare

-         effetto finale dell’assorbimento è l’arrivo al SANGUE ad una [  ] che varia nel tempo (D,M,E)

-         nel sangue F è presente come F libero (D,M,E); F legato a proteine plasmatiche; F legato a cellule circolanti

 -         la [F] libero è condizionata da altri F

DISTRIBUZIONE:

-         trasferimento reversibile del F dal sangue ai vari distretti nell’organismo (BIOFASE)

-         H₂O corporea: plasmatici, interstiziale, intracellulare

-         Per fusione sanguigna

-         Età, salute, obesità

Vi sono diversi modelli per descrivere questo processoà

1)      Modello aperto ad 1 compartimento: plasma e tessuti sono un unico compartimento e l’equilibrio è raggiunto presto

2)      Modello aperto a 2 compartimenti: distribuzione lenta che caratterizza in modo diverso i 2 compartimenti

3)      Modello aperto a 3 compartimenti: ci sono almeno 2 compartimenti tissutali

Dalle curve di concentrazione ematicaàparametri essenziali:

-         t_1/2 à la concentrazione si riduce della metà a distribuzione completa

-         AUC à quantità di F (Q); misura la biodisponibilità

-         Vd à volume di liquidi biologici necessario a contenere il F nella stessa concentrazione plasmatici

-         Cl_t à quota di Vd liberata dal F nell’unità di tempo

-         Vd = Q/Cp à Vd < 20 litri: interstiziale; Vd > 40 litri: anche nei tessuti

BARRIERE BIOLOGICHE:

-         placentareà attraversata da quasi tutti i F

-         BEE (barriera ematoencefalica)à quantitativamente superiore: P₁₇₀ (proteine di trasporto)

La distribuzione concorre anche ad una ridistribuzione (F nel tessuto adiposo).

METABOLISMO:

-         eventi che rendono il F più eliminabile

-         trasformazioni

-         enzimi (reazioni) di FASE 1 (trasformazione, redox, idrolisi) e di FASE 2 (coniugazione)

-         ridotta la lipofilia

-         dipende da: specie, età, sesso, altri F, genetica

-         F che spiazzano un altro F dalle proteine plasmatiche à metabolismo ed escrezione di quest’ultimo

-         Tossificazione

-         Trasformazioni metaboliche à enzimi microsomiali: CITOCROMO P₄₅₀        R-H + O₂ + NADPH + H⁺ à R-OH + NADP⁺ + H₂O

-         Fase di coniugazione, glucuronica: UDPGA + R-X-H ↔ R-X-GA + UDP

PROFARMACO: derivato di un principio attivo che tramite meccanismi metaboliciàripristino del principio attivo dopo A e/o D. Serve per superare i problemi di tossicità.

FARMACO RITARDO: modificazione reattività del F per protrarre la sua permanenza.

ESCREZIONE:

-         renale: FILTRAZIONE (glomerulo)àSECREZIONE TUBULARE (secrete con trasporto attivo sostanze anioniche e cationiche)àRIASSORBIMENTO TUBULARE (diffusione passiva); tanto più F è lipofilo e più viene riassorbito; clearance: = 120 ml/minàultrafiltrato (escreta è riassorbita), > 120 ml/minà secreto (la parte riassorbita è < di quella escreta), < 120 ml/minàriassorbito (la parte escreta è < di quella riassorbita).

-         biliare: F con P.M. > 400-600 kDa secreto dal fegato va nella bile sotto forma di acidi biliari

-         polmonare: eliminati gli anestetici

TRASMISSIONE COLINERGICA:

-         Ach (Acetilcolina): SINTESIàenzima: COLINOACETILTRANSFERASI

       METABOLISMOàenzima: AchESTERASIàidrolizza Ach in Colina    e acido acetico

-         Globulare: G₁ – G₂ – G₄;  code idrofobe per aderire alla membrana

-         Asimmetrica: A₄ – A₈ – A₁₂; coda collagene-like

EFFETTI:

-         stimolazione gangli autonomi e muscoli volontari

-         secrezione A (adrenalina) dal surrene

-         aumenta salivazione

-         bradicardia

-         stimola liberazione N=Oà vasodilatazione

RECETTORI NICOTINICI:

-         nel SNP, nella giunzione neuromuscolare

-         nel SNC, nelle sinapsi gangliari

-         subunità α-β-γ

RECETTORI MUSCARINICI:

-         M₁àazione eccitatoria e si trovano nell’SNC, neuroni periferici e cellule parietali dello stomaco

-         M₂àeffetto inibitorio ed aumentano la permeabilità al K⁺ e si trovano nel cuore, nelle terminazioni presinaptiche dei neuroni periferici e centrali

-         M₃àeffetto eccitatorio, rilasciano la muscolatura liscia per liberare N=O dalle cellule endoteliali e si trovano nelle ghiandole salivari, bronchioli, e ghiandole sudoripare

AGONISTI MUSCARINICI:

-         Ach

-         Carbacolo (meno suscettibili a idrolisi)

-         Metacolina (subito idrolizzata)

-         Pilocarpina (M₃)

ANTAGONISTI MUSCARINICI

-         aboliscono effetti stimolazione parasimpatico

-         atropina (lipofila)

-         ioscina (lipofila)

-         omatropina (lipofila)

-         ipratropioà via inalatoriaà broncodialtazione

TRASMISSIONE NORADRENERGICA:

RECETTORI:

α₁

-         accoppiati a PL-C e svolgono la loro azione grazie al rilascio di Ca⁺⁺ intracellulare

-         vasocostrizione

-         rilasciamento muscolatura liscia intestinale

-         secrezione salivare

-         glicogenolisi epatica

α₂

-         accoppiati negativamente all’Adenilato Ciclasi; < cAMP

-         sugli epatociti, piastrine, muscolatura vasale, neuroni SNC, presinapsi

-         inibizione rilascio mediatori (NA, Ach)

-         inibizione aggregazione piastrinica

-         vasocostrizione

β₁

-         stimolano Adenilato Ciclasi

-         a livello cardiaco

-         effetto IONOTROPO e CRONOTROPO positivo dovuto alle catecolamine

β₂

-         associate all’Adenilato Ciclasi

-         rilasciamento muscolatura liscia (come α₁)

-         broncodilatazione

-         glicogenolisi epatica (come α₁)

-         tremore muscolare

β₃

-         associati all’Adenilato Ciclasi

-         cellule adipose

-         lipolisi

NA (noradrenalina)à neuromodulazione: agisce su recettori presinapticiàmodula suo stesso rilascio

CATECOLAMINE:

-         ricaptate dalla terminazione noradrenergica o da cellule adiacenti

-         catecolamine circolanti sono degradate da enzimi

UPTAKE-1à

-         livello neuronale

-         consentito dalla presenza di un sistema ad alta affinità con velocità massima di trasporto bassa

-         selettivo per NA

UPTAKE-2à

-         captazione extraneuronale

-         bassa affinità per NA ma alta Vmax di trasporto

DEGRADAZIONE:

MAO:

-         monoaminoossidasi

-         all’interno delle cellule e sulla superficie mitocondriale

-         catecolamineàaldeidiàdegradate da aldeidi-deidrogenasi

COMT:

-         catecol-O-metil-transferasi

-         neuroni e in cellule non neuronali

AGONISTI ADRENERGICI:

-         Adrenalina

-         Noradrenalina

-         Salbutamolo

ANTAGONISTI ADRENERGICI:

-         Doxasozine (α₁ selettivo)

-         Fenossibenzamina (α non selettivo)

-         Idazzosano (α₂ selettivo)

-         Propronololo (β – β₂ selettivo)

INIBITORI SINTESI NA:

-         Metildopa

AMINE SIMPATICOMIMETICHE:

-         Efedrina

-         Amfetamina

INIBIZIONE REUPTAKE NA:

-         Antidepressivi Triciclici

ANTIINFIAMMATORI

FANS: Farmaci Antinfiammatori non steroidei

-         antinfiammatori

-         analgesici

-         antipiretici

-         inibizione COX (ciclo ossigenasi) dell’acido ARACHIDONICO à inibizoone PG (prostaglandine) e TA (trombassani)

-        COX-1àcostitutiva, trasmette segnale cellula-cellula (inibizione causa effetti collaterali)

-        COX-2àinduttiva, stimolata da cellula infiammata, produce PROSTANOIDI, mediatori infiammazione. Inibizione causa azione antinfiammatoria)

F SELETTIVI COX-1àindometacina

F SELETTIVI COX-2àBF-389

F SELETTIVI COX-1/2àaspirina, piroxicam, ibuprofene, diclofenac, naproxene, nabumetone

ENZIMIàsiti di bersaglio per i F

1)      normalmente il F è un substrato analogo che agisce come inibitore competitivo

2)      F agisce come falso substrato

Occorre però:

-         correlazione tra entità inibizione enzimatica ed effetto farmacologico

-         inibizione in vitro e in vivo

-         correlazione tra dose F, effetto, inibizione enzimatica

POMPA Na⁺/K⁺ ATPasi DIPENDENTE:

I F glucosidi cardioattivi agiscono su tale meccanismo per la cura di insufficienza cardiaca

Na⁺/K⁺:

-         controlla il volume cellulare

-         mantiene il gradiente sodio/potassio

-         nelle cellule eccitabili è implicata nella conduzione dell’impulso

-         pompa ATPasica

-         3 Na⁺ esternate e 2 K⁺ internate à omeostasi cellulare

-         Distribuzione asimmetrica della pompa nelle cellule epiteliali

-         Distribuzione simmetrica in cellule non-epiteliali

-         Antiporto

-         Regola indirettamente lo scambiatore Na⁺/Ca⁺²

Diverse isoforme:

-         α₁à ubiquitaria; renale

-         α₂à muscolo (scheletrico e cardiaco)

-         α₃à nel SNC (presenti però tutte e tre le forme)

GLICOSIDI CARDIOATTIVI:

-         digitatici o cardiosteroidi (ouabaina)

-         si legano alla pompa sodio/potassio impedendone il funzionamento

-         derivazione vegetale contenenti zuccheri (glucosidi) legati ad anello steroideo

-         aumenta forza contrazione cuore (INOTROPO positivo)

-         aumenta Ca⁺⁺ intracellulare, inibizione Na⁺/K⁺ ATPasi, effetto INOTROPO positivo

CONTRAZIONE MIOCITA: stimoliàapertura canali Na⁺àNa⁺ in cellulaàapertura canali Ca⁺² di tipo Làcontrazioneàpromuove liberazione Ca⁺²àcontrazione.

Nel plasma umano ci sono fattori endogeni simili ai digitatici:

-         2 simili alla OUABAINA e DIGOSSINA prodotti dalla midollare del surrene

-         1 fattore ipotalamico

Aldosterone, corticosteroneà espressione genica pompa Na⁺/K⁺ ATPasi

EGF, vasopressina, glucagoneà modificazione post-trascrizionale con secondo messaggeroà aumenta il numero di pompe presenti e aumenta il turn-over.

POMPA PROTONICA GASTRICA:

-         H⁺/K⁺ ATPasi

-         Determina secrezione di H⁺

-         INIBITORIàF antiulcera (omoprazolo): si lega irreversibilmente sulla subunità catalitica

RESISTENZA MULTIFARMACOLOGICA:

Gene MDR1 codifica per una P-glicoproteinaà

-         abbondante nei tumori

-         trasportatore che riduce influsso di F e ne aumenta l’eflusso.

PURIFICAZIONE E ISOLAMENTO DI RECETTORI:

occorre:

1)      organo ricco di R (organo elettrico Torpedo con R per Ach simile all’uomo)

2)      composto che si leghi irreversibilmente

Se [R] è bassaàstudi di binding su struttura-attività ma non sulla tridimensionalità

TESSUTO BIOLOGICOà

-         solubilizzazione: detergente simile a colesterolo

-         purificazione: cromatografia

-         determinazione struttura: elettroforesi (SDS)

Per trovare la struttura 1° e 3°àBIOLOGIA MOLECOLARE: si parte dal DNA della proteina

Per risalire al gene della mia proteinaàCLONAGGIO dei R: cDNA library e SCREENING cDNA di interesse.

ESECUZIONE:

1)      OMOGENATOàcentrifugazioneàpellet contenente mRNA

2)      mRNA + TRASCRITTASI INVERSA à elica di DNA complementare all’mRNA; separo la catena di DNA e aggiungo DNA POLIMERASI à cDNA a d.s. (double strand)

3)      cDNA in vettori plasmidici, tagliando con enzimi di restrizione e saldando con DNA LIGASI

4)      selezione del clone ricombinante su terreni selettivi: inserisco cDNA in mezzo ad un gene che dà resistenza ad un antibiotico (ricordo che nel vettore plasmidico ci sono 2 geni per resistenze ad antibiotici) à mescolo i plasmidi con E. coli à mezzo di coltura + Ampicillina à mezzo di coltura +  Tetraciclina. Se i batteri non crescono su di uno, allora sono ricombinanti in quanto uno dei due cDNA è andato ad inserirsi al posto di un gene della resistenza

5)      con la riproduzione di E. coli à CLONE (libreria di cDNA)

6)      SCREENING LIBRERIA in due modi:

-         tramite Ab à per riconoscere un clone che fabbrica insulina, uso Ab (anticorpi) che riconoscono questa molecola e sono fissati su una piastra di plastica. La metto in contatto con un gruppo di cloni. La piastra con molecole di insulina attaccate su, viene appoggiata su un’altra piastra con Ab “etichettati” con ISOTOPO* (radioattivo) e anche essi si attaccano all’INSULINA. La piastra con Ab-insulina-Ab*àautoradiografia e dalla posizione risalgo al clone di origine.

-         tramite oligonucleotidi à Petri con più cloni: le cellule vengono “rotte” e il DNA denaturato à aggiungo sonda-RNA* (radioattiva, 10-15 aa) à appaiamento al filamento di DNA con sequenza complementare à IBRIDO RNA-DNA e con autoradiografia identifico la colonia col mio cDNA. Per avere ulteriore conferma, se ho clonato con oligonucleotidi eseguo il riconoscimento proteina con Ab. Per conoscere la struttura 1° della proteina à PROFILI DI IDROFOBICITA’ (in membrana)

OBIETTIVI RAGGIUNTI:

-         clonazione R umani per neurotrasmettitori

-         trasfezione lievito

-         studio di vari sottotipi di R

-         conoscenza dei siti funzionali tramite mutazioni puntiformi

-         produrre Ab contro proteina (Ab monoclinali)

-         delucidazione traduzione

-         mancano informazioni sulla 3D (tridimensionalità)

AB MONOCLONALIà Ab selettivi contro una ben definita parte di R

Antigene (con determinanti antigenici) + linfociti B à PLASMACELLULEà Ab nel siero contro i determinanti antigenici. Mi occorrono Ab monoclinali in grado di riconoscere un solo determinante antigenico.

PRODUZIONE AB MONOCLONALI:

-         determinanti antigenici iniettati in topoàIMMUNIZZAZIONE

-         fusione tra cellule di MIELOMA (pure) e linfociti B (siero policlonale) del topo

-         formazione di IBRIDOMI e cellule non fuse

-         distinzione IBRIDOMA da MIELOMA à diversa capacità metabolica

-         terreno selettivo con AMINOPTERINA (blocca diidrofolato redattasi che consente la sintesi di purine e pirimidine da composti semplici) à sopravvivono solo le cellule che hanno la 2° via metabolica (timidina kinasi e ipoxantina fosforibosiltransferasi partendo da timidina e ipoxantina e non è presente nel mieloma)

-         solo gli IBRIDOMI sopravvivono

-         diluizione limite à cellule singole in coltura

-         cloni che ne derivano à Ab con UNICA SPECIFICITA’

DINAMICA DEI RECETTORI:

Il R è un’entità dinamica.

Individuazione di PIT (invaginazioni di membrana) e vescicole libere nel citoplasma e sono COATED e appaiono dense al microscopioà queste strutture sono legate all’internalizzazione di materiale extracellulare.

DOWN REGOLATION:

ENDOCITOSIà

-         processo in cui la cellula internalizza costituenti extracellulari

-         fagocitosi / pinocitosi

-         aspecifica: in base alla [  ] del mezzo extracellulare

-         specifica: o mediata da R, la cellula può internalizzare il 50% della sua superficie

ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI:

-         ingresso in cellula di nutrienti e molecole

-         ingresso di EGF o INSULINAàdown regulationàinternalizzazione R; meccanismo di controllo del segnale; trasporto a livello del sito d’azione

-         Ràdegradato; resintetizzato; riesposto

-         fenomeni di desensibilizzazione a diversi agonisti

-         presentazione di Ag (antigeni)

COATED VESCICLES:

-         diversi destini e origini cellulari e diversi ruoli:

-         endocitosi

-         trasporti vari; di orfanelli contenenti DR (DRUG-RECEPTOR ovvero Farmaco legato a Recettore)

-         limitazione stimolo prodotto da DR

-         trasporto nel nucleo di materiale biologico

-         esocitosi

-         riciclaggio componenti di membrana

Prerequisito per i processi di internalizzazioneàBINDING di materiale extracellulare al R

FARMACOLOGIA: coated pits & vesciclesà evidenza istologica di strutture capaci di internalizzare R, DR, D

RECETTORI DI MEMBRANA:

-         medium dinamico

-         interazione ligando-Ràformazione di un CLUSTER di DR (no energia)àaggregati più grossiàmigrazione del complesso DR di qualche µm (CAPPING, occorre energia)à reclutamento e rivestimento di CLATRINA nella parte citoplasmaticaàformazione rivestimentoàinternalizzazione coated-pits a dare le coated-vesciclesàclatrina riutilizzata.

CLATRINA:

-         triskelion (3 catene pesanti 180 kDa più 3 catene leggere 35 kDa)à 640 kDa

-         36 triskelionàrete di 12 pentagoni e 8 esagoniàcanestro poliedrico

-         Proteine accessorie: tubulina e glicoproteina

-         Si lega alla vescicola con legami deboli

-         Adaptor Proteins (AP) associate alla latrina e fanno in modo che le vescicole siano rivestite da clatrina correttamente

ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORI:

1)      ligando internalizzatoàconfinato nel sistema endo-lisosomiale mentre il R ricicla in membrana: LDLàLDL che trasporta il colesterolo viene degradato

2)      sia R che ligandoàsueprficie: TRANSFERRINA-Receptorà(degradato solo il R e non la transferrina che trasporta il Ferro). APOFERRINAàtransferrina senza Fe.

3)      R e ligandoàdegradati a livello lisosomiale: EGF-Receptor

4)      TRANSCITOSI: R e L (L = ligando) esposti sul lato opposto della membrana cellulare.

INTERNALIZZAZIONE:

R non cambia

R incrementa

R decrementa

DOWN-REGULATIONà

-         TACHIFILASSI: la cellula non risponde a stimoli che arrivano in breve tempo

-         TOLLERANZA: la cellula non risponde a stimoli che gli arrivano ma si verifica in tempi più lunghi

-         DESENSIBILIZZAZIONE (Down regulation, tachifilassi, tolleranza)

RECETTORI INDUCIBILI:

-         condizioni patologiche o fisiologiche à induzione trascrizionale

-         UP-REGULATION: aumento espressione funzionale di R preesistenti

INDUZIONE:

-         transiente, mantenuta dallo stimolo

-         de novo R per nuove risposte

-          condizioni fisiologicheàangiogenesi; manipolazioni ormonali

-         Condizioni patologicheàinfiammazione; EGF; infezioni virali

NF-kB:

-         attivazione importante per molti R inducibili

-         attivazione può avvenire tramite RAS7RAF

-         tessuto-specificità

-         rimodellamento cellulareàregolazione temporanea sensibilità cellula

CAVEOLAE:

-         invaginazioni di 50-100 nm che sono un’appendice della membrana plasmatici

-         caveolina: proteina integrale di membrana (20 – 22 kDa)

-         tante caveoline adiacentiàCAVEOLAE

-         caveolina + lipidi

2 stadi di sepf-associazioneà

1)      oligomerizzazioneàda monomeri a dimeriàHMN oligomero

2)      interazione oligomero-oligomeroàCAVEOLAE

      4 tipi di caveoline:

1)      CAV 1αàmuscolo liscio, adipociti

2)      CAV 1βà muscolo liscio, adipociti

3)      CAV 2à adipociti

4)      CAV 3à muscolo scheletrico e cardiaco

      Regione precisa che media interazione:

-         CAV-CAV: citoplasmtic region 41 aa (61-101)

-         CAV-PROTEINS: COOH-terminal 20 aa (82-101)àSCAFFOLDING DOMAIN

RUOLO:

-         funzione nell’endocitosi R-dipendente

-         POTOCITOSI: piccolo molecole che devono entrare in cellula

-         TRASCITOSI

-         Immagazzinamento di molecole segnale o substrati enzimatici

-         Traduzione segnaleàmolti R risiedono in caveolae

-         Polarità cellulare

-         Alterazione caveolaeàpatologie

CAVEOLINE BINDING MOTIFànelle Gα e nel dominio kinasico di molte PK (fosfokinasi)

Complessi oligomerici legati alla membrana che contengono elementi del citoscheletro e molecole segnale.

FARMACI ANTIGENE E ANTISENSO

-         modificano la produzione di una proteina

-         si legano a siti specifici degli acidi nucleici (DNA – RNA)

-         target recettoriale nucleare

-         ODN à oligodeossinucleotidi: non modificano il menoma

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSOà

-         piccole sequenze DNA/RNA con basi complementari ad uno specifico gene o mRNA

-         bloccare la produzione di proteina virale

-         formazione DUPLEX RNA-OLIGONU à NO-TRADUZIONE

-         formazione TRIPLEX DNA-OLIGONU à NO-TRASCRIZIONE

VANTAGGI ODN:

-         inibire 1 geneàinibire migliaia di copie di proteina

-         semplicità progettazione chimica

-         indice terapeutico favorevole; specificità interazione e minor effetti collaterali

SVANTAGGI ODN:

-         scarsa stabilità chimica nei liquidi biologici

-         no specifici sistemi di trasporto attraverso barriere

-         alti costi di sintesi

SCELTA OLIGONu:

-         lunghezza: 20-25 Nu à < 20 Nuà no riconoscimento; > 25 Nuàproblemi di assorbimento

-         selezionare anche OLIGO con errori

-         rapporto CG/AT ≤ 50%

-         controllare proteina target

-         controllare eventuale tossicità

-         utilizzare più antisense

-         prove per verificare che l’antisense abbia funzionato (binding, western blot)

ENTRATA OLIGO IN CELLULA:

-         hanno una carico negativa (-) su ogni gruppo P (fosfato) quindi per aumentare la stabilità occorre usare metilfosfonati (ma sono poco solubili) o fosforotionati (solubili)

-         diffusione passiva secondo gradiente o per endocitosi specifica (Receptor Mediated Endocitosis) o aspecifica

TARGET:

-         nucleare: (triplex) blocco trascrizione. Può legarsi alla regione di controllo impedendo il legame dell’RNA-Polimerasi o alla regione codificante spiazzando la RNA-Polimerasi

-         citosolico: (duplex) blocco traduzione impedendo ai ribosomi di iniziare o completare la traduzione oppure tramite attivazione di un enzima ubiquitario (RNAasi-H) che idrolizza mRNA nel sito di legame col F

ANTISENSE OLIGO:

-         triplex

-         Lega mRNA nascente e previene traduzione

-         Lega esone

-         Lega esone-introne

-         Lega mRNA e impedisce trasporto dal nucleo

-         Lega mRNA 5’CAP; AUG

BIODISPONIBILITA’ degli OLIGO è ridotta da:

-         degradazione da nucleari

-         legami a proteine

-         legami a lipidi

-         compartimentalizzazione in endosomi

Per ovviare al problema delle nucleari posso fare sostituzioni: fosfoetiltriesteri o metilfosfonati.

Per aumentare la biodisponibilità cellulareà

-         ridurre legami aspecifici

-         oligo più liofili (coniugo con colesterolo)

-         oligo nei LIPOSOMI che proteggono dalla degradazione enzimatica e assicura un efflusso lento per molti giorni

-         etichetto gli oligo verso le cellule con Ab

IAR: Intracellular-expressed Antisense RNA

-         cellule trasformate ex-vivo con gene ricombinanteàsintesi di RNA complementare

-         antisenso più lungo incrementando la possibilità di ibridazione

-         superano i problemi legati alla penetrazione

-         problemi di tossicità

-         applicazione su HIV e CANCRO

ODN:

Effetto concentrazione dipendente

Effetto di un ODN confrontato con ODN simili a lunghezza e sequenzaà

-         SCRAMBLED SEQ: basi uguali ma ordine diverso

-         MISMATCHED SEQ: solo alcune basi diverse

-         ODN SENSE: stessa sequenza del messaggero

TOSSICITA’-MUTAGENICITA’:

1)     tossicità cellulareàinterferenza con proteine cellulari

2)     tossicità sequenza dipendenteà proteina non più prodotta: effetto farmacologico buono

3)     tossicità sequenza indipendenteàlegame ad altre proteine in maniera aspecifica

ODN non sono mutageni.

FARMACOCINETICA degli ODN: tutti i tessuti escluso il cervello; si legani all’albumina; non sono tossici a lungo termine (febbre, ipotensione).

APPLICAZIONI CLINICHE:

-         terapia antivirale

-         terapia antitumorale

-         neuroimmunologia

FARMACOLOGIA TRASCRIZIONE GENICA

I meccanismi molecolari che regolano l’espressione di una proteinaàregolazione trascrizione relativo gene da parte di RNA-Polimerasi-2.

FORMAZIONE COMPLESSO DI INIZIO:

-         alla TATA-box si legano fattori di trascrizione (D, B, F)

-         successivamente si lega la POL-2 (assistita da diversi fattori: TF2D etc), E, H

-         si legano poi gli ATTIVATORI in sequenze a monte della TAT-box

-         GRE = glucocorticoid response elements

-         CRE = cAMP response elements

-         UPE = Up-stream promoter elementsàsequenza DNA a cui si legano i fattori di TRASCRIZIONE

La funzione e l’espressione di molti attivatori è regolata da stimoli extracellulari quali stress, ormoni, stimoli ossidativi.

3 CLASSI DI FATTORI DI TRASCRIZIONE:

1)      attivati da ligando, R per ormoni steroidei

2)      attivati da modifiche post-trasduzionali: CREB, STAT, NF-kBàfosforilati da PKA, PKC, MAPK ma che a loro volta fosforilano

3)      regolati a livello trascrizionale

REGOLAZIONE TARSCRIZIONE DA STIMOLI EXRACELLULARI:

-         1° classe: ormoni steroidei diffondono per lipofiliaàcitoplasma su R per ormoni steroideiàattivano trascrizione nucleare nel nucleo

-         2° classe: segnali extracellulariàsecondi messaggeriàkinasiàSTAT entra nel nucleo o CREB è già nel nucleoàgene fattore trascrizionale (3° classe)

-         3° classe: mRNA esce dal nucleoàproteinaànucleo per regolare trascrizione di altri geni

NF-kB:

-         fattore di trascrizione e regolazione

-         regola espressione catena K delle IgG nei linfociti B, è però ubiquitario

-         espressione geni coinvolti nell’infiammazione

-         stimoli extracellulari

-         bersaglio per F antinfiammatori

-         GLUCOCORTICOIDIàtrascrizione IKB. R attivato dai glucocorticoidiàNF-kB-IKBàainattivazione

-         ASPIRINAàinibisce dissociazione NF-kB-IKB

TERAPIA GENICA:

-         introdurre uno o più geni nelle cellule somatiche di uno o più tessuti del paziente

-         utile in malattie che arrecano deficit proteico, cancro, AIDS

1) EX-VIVO:

-         cellule prelevate da paziente, coltivate, inserito il gene e cellule reiniettate          nell’uomo (cellule emopoietiche)

-         VANTAGGI no risposta immunitaria

-         SVANTAGGI: laboriosa

2) IN VIVO:

-         gene terapeutico inserito direttamente nelle cellule del paziente

-         VANTAGGI: più semplice e utilizzabile su ampia scala

-         SVANTAGGI: resa bassa per cellule che si dividono poco; difficile evitare che il gene non vada in altre cellule; vettore può scatenare risposta così come la proteina di interesse se non è mai stata prodotta dall’organismo

VETTORIàDNA normalmente non supera la membrana e comunque viene degradato o fagocitato MA il vettore può attivare un oncogene e causare neoplasie.

-         VIRALI: capacità di penetrare in cellula (retrovirus, adenovirus, herpes virus) possibilità di risposte immune degradatoria

-         RETROVIRALI: MMLV (virus leucemia murina di Maloney), il menoma virale è quasi totalmente deleto e dopo un po di tempo l’espressione si riduce p scompareàmetilazione. Problema della modulazioneàtroppa proteina è dannosa.

-         ADENOVIRALI: si possono inserire DNA lunghi; infettano bene le cellule; non si integrano nel menoma della cellula tradotta; buoni se la terapia è transiente

-         HERPES VIRUS e LENTIVIRUS: bene rispettivamente per SNC e AIDS ma hanno un’intrinseca patogenicità

-         NON VIRALI: LIPOSOMIàfibrosi cistica in cui manca il gene per il trasporto del Cl^-

Con la terapia genica oggi si curano alcune malattie:

-         SCID (Sindrome Immunodeficienza Acquisita) dovuta a carenza di ADA (Adenosina deaminasi)àinfusione di ADA nei liposomi

-         DIABETE

-         CANCROàeliminare tutte le cellule cancerose; immunoterapia (cellule tradotte in vitro con plasmidi che codificano per Ag tumorali e reiniettateàreazione T-citotossica); strategia citotossicaàcellule tumorali con geni suicidi

-         Delle cellule GERMINALIàpassa alle generazioniàetica.

RECETTORI:

Molecola che lega in modo specifico, definito e con affinità precisa uno o più mediatori endogeni e da ciòàtrasformazione conformazionaleàeffetto biologico

1) INTRACELLULARI:

-         legano ormoni e mediatori liofiliàinteragiscono col genoma modificando l’espressione

-         legati ad HSP (Heat Shock Proteins) e quindi inattivati

-         Responsive Elementsàsequenze specifiche dei promotori

2) DI MEMBRANA:

-         CANALI IONICI aperti da legame con neurotrasmettitori

-         GPCR

-         INTEGRINE di matrice extracellulare

-         R per le CITOKINE

-         R con attività fosfokinasica intrinseca

-         R con attività guanilatociclasica

Classificati in base al ligando e alla struttura.

RECETTORI DI MEMBRANA:

R CANALE (IONOTROPI):

-         complessi macroproteici transmembranaàcanale ionico

-         attivati da neurotrasmettitore

-         rapidi cambiamenti [ioni]

-         R nicotinici, GABA, R-Gly, Ionotropi per il Glu, 5-HT3 per serotonina, P_2x per purine

-         4/5 subunità ognuna delle quali attraversa 4 volte la membrana M1-M4

-         Canale limitato dalle porzioni M2

-         Selettività data da aa carichi elettricamente disposti ad anello

-         Sito di legame extracellulare su subunità α e altre posizioni

-         Siti allostericiàmodificano attività del canale

-         Siti di fosforilazione nella parte citoplasmatica

-         Siti di legame proteine/citoscheletro

-         F agisce su siti di legame dell’agonista, siti allosterici, nel lume

-         RUOLO: trasmissione sinaptica veloce; diverse subunità per determinare canale ionico; apertura canale dopo legame col ligando (mSec)

-         R canaleàil F si legaàapertura

-         R canale voltaggio dipendenteàil F modula ma l’aperturaàΔV

-         PATCH CLAMP: registrazione a tassello per studiare porzioni di membrana e registrare correnti che fluiscono attraverso canali ionici e classificarli.

R METABOTROPI:

-         accoppiati a G-proteine

-         più numerosi

-         GTP

-         Cascata enzimatica di 2° messaggeriàeffetto biologico

-         F agisce su sito di legame dell’agonista; F agonisti e antagonisti; attivazione proteina G; produzione e distruzione 2° messaggeri

R ATTIVITA’ TIROSINKINASICA INTRINSECA:

-         R per molti fattori di crescita

-         Una catena che attraversa una sola volta la membrana

-         Autofosforilanoàcascata di eventi

-         OncogeniàR per fattori di crescita che hanno perso la regolazione fisiologica

-         F agisce solo su sito agonista

R CON ATTIVITA’ GUANILATO CICLASICA:

-         R per il peptide natriuretico

-         Se alteratiàneoplasie

MODULAZIONE RECETTORI:

1)                 a livello di produzione e degradazione del mediatore (feedback)

2)                 a livello di interazione mediatore-recettore; è reversibile e l’attività del R è controllata dalla K_D (modificata con fosforo dalla cellula)

3)                 a livello trasduzionale (desensitizzazione, down-regulation, up-regulation)

4)                 a livello di spegnimento del segnale generato dal R; attività di fosfatasi e fosfodiesterasi sono controllate dallo stesso 2° messaggero

5)                 a livello di induzione di R (bradikinina nell’infiammazione)

R NICOTINICI-COLINERGICI:

-         R-IONOFORIàlegano Ach e aprono canale per il Na

-         Espresso ad alta densità (10.000 molecole/µm² nell’apice delle pieghe della membrana postsinaptica della giunzione neuromuscolare)

-         5 subunità glicoproteiche

-         Parte extracellulare a forma di imbuto per raccolta ioni ed è presente il sito di legame per il neurotrasmettitore

-         Estremità N e C terminali extracellulari

-         Nell’attraversare la membrana il R si restringeàPORO selettivo per gli IONI

-         Anelli carichi negativamente (-) per attrarre ioni positivi (+): in questa regioneàPORTA che si apre con il legame Ach

-         Nel citoplasma si riallarga il canale e sono presenti siti di fosforilazione e siti di legame con le proteine del citoscheletro (43kDa)

-         2 siti per Ach sulle subunità α e interagiscono con COOPERAZIONE POSITIVA

-         Canale costituito da M2 (M1-M3-M4 per la struttura)

-         Sito di legame Achàtasca idrofilia; zona importante tra aa 180 e 200àCys192 e Cys193; legami accessori con Tyr e Trp su altre subunità

-         Un unico gene codifica per le 2 subunità α anche se le 2 subunità hanno una diversa capacità di binding

-         Ach si lega a un sito (-) e (+), li avvicinaàslittamento tra subunitààapertura canale

-         Apertura del canaleàdepolarizzazione della membrana

-         R per Ach non ha elevata capacità di selezione tra diverse specie ioniche con ugual carica.

CANALE IONICO:

-         Definito in seguito ad uso di Non Competitive Blockers (NCB)

-         Legandosi ad un sito diverso blocco effetto Ach in maniera non competitiva

-         Riduco durata apertura e/o aumento desensibilizzazione

-         Regolazione allostericaànel canale: 1 molecola (HIGH AFFINITY); nel bilayer: 10-30 molecole (LOW AFFINITY)

-         CloropromazinaàNCB, lega alla Ser di 4 subunità poste su M2 (formano le pareti canale)

-         Attivazione continua del canaleàDESENSITIZZAZIONE (proprietà intrinseca solo per canale nicotinico)

Il R esiste in diversi stadi conformazionaliàRESTING (riposo); ACTIVE (attivo); DESENSITIZZATO (inattivo, desensitizzato)

-         ANTAGONISTI COMPETITIVIàfavorisocno la forma Restino

-         AGONISTIàfavoriscono la forma Active e a lungo andareàDesensitizzato

-         MUTAZIONE dell’anello M2 in Leuàil R non si desensibilizza

PKAàfosforila subunità δ ed ε à aumenta apertura spontanea di R

PKCàfosforila α₁ e δ à aumenta velocità con cui R si desensibilizza

TKàfosforila β₁ e δ à kinasi attivate da 2° messaggeri prodotti da altri R

I RECETTORI dell’ACH sono:

-         nicotinici (ionotropi) à neuronali

-         muscarinici (metabotropi)

-         10 geni: 8 subunità α e 3 subunità β

-         M2 delimita il canale

-         Subunità analoghe a AchR muscolare

-         Processi apprendimento, memoria, Alzheimer

MIASTENIA GRAVE:

-         debolezza muscolare

-         affaticamento

-         scarsa resistenza

-         ptosi palpebrale

-         associata a timoma

-         diminuzione recettori nicotinici postsinaptici a causa di Ab specifici

-         TERAPIAàanticolinesterasici, farmaci immunosoppressori, timectomia

GABA:

-         neurotrasmettitore inibitorio

-         decarbossilazione acido glutammicoàglutammato decarbossilasi (GAD)

-         GABA-Tàenzima che degrada il GABA

EPILESSIA causa una diminuzione del tono inibitorio

-         valproato di Na⁺: stimola GAD e inibisce GABA-T à non interviene sul R e quindi aumenta GABA

-         acido nipecotico: blocca uptake neuronale di GABA à non interviene sul R e quindi aumenta GABA

NEUROTRASMETTITORE:

-         aumenta la concentrazione di GABA e GAD nei sinaptosomi (artefatti)

-         liberazione spontanea ed evocata da stimolazione

-         R per GABA (acido gamma-amino-butirrico)

-         Sistema di ricaptazione

-         Nel SNC e midollo spinale

3 tipi di R:

1)      GABA_A: R canale del Cloro, nella corteccia, talamo, cervelletto, midollo spinale, rene, pancreas; sito di binding per BZ (benzodiazepine) e F convulsivanti

2)      GABA_B: associati al K⁺ e Ca⁺²; non legano BZ ma baclofen; nel SNC, presinaptici (inibiscono canali VOCC e rilasciano neurotrasmettitori) e postsinaptici (canale K⁺àiperpolarizzazione)

3)      GABA_C: associati a canali per il Cl^-; nella retina; insensibili alla bicucullina e  baclofen

GABA_B:

-         SNC

-         Periferia: gangli, utero, cellule muscolari lisce, fegato

-         A livello presinapticoàliberazione neurotrasmettitore

-         Metabotropi accoppiati a A-proteine

-         Modulano riduzione Adenilato Ciclasiàdiminuzione fosforilazione canali Ca⁺²àriduzione influsso di Ca⁺²àriduzione release di neurotrasmettitori

-         Accoppiati a PLC e/o canali

-         GABA_B1àSNC

-         GABA_B2àperiferia

-         ANTAGONISTI: bloccano R GABA_B; per ripristinare la memoria; faclofen

-         AGONISTI: nelle sindromi depressive

GABA_C:

-         retina

-         canale del Cl^-

-         R- IONOTROPO insensibile ad antagonisti come bicucullina e BZ

-         Subunità ρ₁ ρ₂ àOMOOLIGOMERI

-         Non desensitizzano

-         Da questi può essersi evoluto il GABA_A

-         Controllo inibitorio delle risposte indotte dalla luce

GABA_A:

-         pre e post sinaptico

-         accoppiati al canale del Cl^-

-         R per neurotrasmettitori INIBITORI nel cervello

-         pentomero

-         Il GABA si lega d un sito di legame primarioàingresso Cl^- nelle cellule nervose che si iperpolarizzano e quindi non possono raggiungere il potenziale d’azione

SITO DI LEGAME (principalmente su β)

-         per GABA

-         F GABA-mimetici (muscimolo)

-         F GABA-antagonisti (bicucullina)

SITO DI LEGAME (α,β,γ, effetti opposti alle BZ che causano ansia e convulsioni):

-         per BZ

-         F BZ-mimetici (β-carboline)

SITO DI LEGAME (all’interno del canale BT, etanolo, anestetici generali, steroidi):

-         per barbiturici (BT)

-         F BT-antagonisti (picrotossina)

-         Per organofosfati

BENZODIAZEPINE:

-         ansiolitici, ipnotici, anticonvulsivanti, effetto miorilasciante e se si aumenta la doseàatassia

-         si legano alla subunità α e sono modulatori positivi del GABA

-         facilitano trasmissione GABAergica

-         range terapeutico alto

-         la subunità γàcapacità alle BZ di modificare allostericamente la conformazione β dove si trova il GABA BINDING SITEà aumenta flusso di Cl^-àiperpolarizzazione

-         sinergismo farmacologico

-         aumentano la frequenza di apertura del canale

-         sito di legame BZ-1àhigh affinity, nel cervelletto,

-         sito di legame BZ-2àlow affinity, ippocampo, corteccia, midollo spinale

-         sito di legame BZ-3àlow affinity, cervelletto

-         β-carbolineàansiogeno

LIGANDI ENDOGENI per sito BZ:

-         modulatori allosterici

-         GABA modulino

-         DIF (diazepam inhibitory factor)

-         Β-carboline

-         DBI (Diazepam binding inhibitor)

-         ODN (octadecaneropeptidi) si frammentano in DBI e hanno attività ansiogena

AGONISTI:

-         BZ (nitrozepam, triazolam)

-         Imidazopiridine (zolpidem)

-         Derivati β-carboline (aberconil)

-         Effetti ansiolitico, ipnotico, anticonvulsivante

-         Potenziano la trasmissione GABAergica

AGONISTI PARZIALI:

-         imidozenil

-         bretozenil

-         efficacia inferiore a BZ ma buona attività ansiolitica e anticonvulsivante

-         meno effetti collaterali

-         ripristino normale funzione GABAergica

ANTAGONISTI:

-         flumazenil

-         spiazzano le BZ

-         tolleranza e dipendenze dalle BZ

AGONISTI INVERSI:

-         β-carboline

-         proprietà opposte a BZ

-         modula in senso negativo l’attività del R per il GABA riducendo la sensibilità al GABA

TOLLERANZA alle BZ:

-         molecole con elevata affinità

-         buona attività ma breve durata d’azione

-         alterazioni mRNAàmodifica subunitààinsensibilità ai F

BARBITURICI:

-         potenziano azione GABA legandosi nel lume del R

-         aumentano tempo di apertura del canale

-         attivano flusso Cl^- indipendente da GABA

-         depressione dose-dipendente generalizzataàcomaàmorte

-         basso indice terapeutico

PICROTOSSINA e TBPS Binding Siteàall’interno del canale e riducono entrata del Cl^- per ingombro sterico

NEUROSTEROIDI e GABAàsteroidi: modulatori allosterici del GABA_A

-         aumentano attività agonisti

-         aumentano attività BZ

-         a dosi elevate attivano direttamente il R

-         alcuni modulano negativamente la funzione del R del GABA

-         sito in prossimità del canale

-         incrementano la durata media di apertura del canale e aumentano la frequenza di apertura (BZ)

-         vengono prodotti anche nel SNC e partecipa il recettore BZ-3 mitocondriale che trasforma colesteroloàprogesterone

-         modulatori positivi della trasmissione GABAergica, potenziano il flusso di Cl^-

-         a basse dosi hanno effetto simile a BZ e a dosi elevate simile a BT

-         attività anestetica, anticonvulsivante

-         manca antagonista selettivo

ANESTETICI GENERALI:

-         potenziano trasmissione GABAergica

-         aumentano ingresso di Cl^-

ETANOLO:

-         anestetico generale

-         sinergia con BZ e BT

-         importante Ser-Loop intracellulareàfosforilazione PKCàinfluisce l’alcool su tale sito

R per GLICINA:

-         neurotrasmettotore inibitorio

-         nel midollo spinale e corteccia cerebrale

-         IONOFORO del Cl^-

-         Proteina pentamerica (3α e 2β)

-         Simile a AchR e GABA_A

-         Recettore canale

-         AGONISTIàGly, β-alanina

-         ANTAGONISTIàstricnina (veleno)

-         GlyR è tenuto in loco da gefrina legata a subunità β e collegata al citoscheletro

-         GlyR nei neuroniàCLUSTERS, grazie alla gefirina, nella membrana postsinaptica

MODULAZIONE R:

-         Zn^{+2 a basse concentrazioni aumenta attività del GlyR, ad alte concentrazioni la inibisce}

-         Fosforilazione: PKA aumenta attività GlyR, PKC diminuisce attività GlyR

-         Eventi multipli di fosforilazione regolano GlyR attraverso un CROSSTALK Cellular Mechanism

PATOLOGIE:

-         sclerosi laterale

-         Parkinson

-         Perdita neuronale

-         Sindrome spastica

-         Mutazione puntiforme α₁àiperiflessia umana e diminuisce affinità Gly

FARMACOLOGIA:

-         AGONISTIà β-alanina e Serina

-         ANTAGONISTIà Stricnina: eccitazione SNC e si lega con alta affinità

-         BZ e BTà aumenta tono inibitorio a livello centrale

CANALI IONICI VOLT-DIPENDENTI

-         pori macromolecolari che permettono flusso di IONI (Na⁺, K⁺, Ca⁺²) ed hanno effetti su potenziale di membrana

-         componenti carichi che avvertono il campo elettrico

-         chiusi normalmente ma con ddp (differenza di potenziale)àaperti

RIPOSO:

-         filtro di selezione aperto

-         cancello di in attivazione chiuso

-         il canale risulta CHIUSO

APERTO:

-         filtro di selezione aperto

-         cancello di in attivazione aperto

-         il tutto risulta APERTO

INATTIVAZIONE:

-         filtro di selezione aperto

-         cancello di in attivazione chiuso

-         il tutto risulta INATTIVATO

CANALI VOLT-DIPENDENTI:

-         macromolecole PM~200kDa

-         filtro di selettività all’esterno

-         poro acquoso

-         cancello di in attivazione nel citoplasma

-         sensori di voltaggio regolano il cancello

-         proteine che ancorano in membrana il canale

-         subunità principale α (autonoma e con sensore) e diverse subunità accessorie

-         N e C-ter intracitoplasmatici

-         α ha 4 territori omologhi (transmembrana) che formano il canale e ogni territorio ha 6 segmenti transmembrana. Tra il 5 e 6 c’è una zona detta p o M5 che siimmerge nella membrana senza attraversarla e forma l’imboccatura del poro

CANALE AL Na⁺:

-         PM ~ 250kDa

-         Struttura pseudotetramericaà4 domini di cui ogni dominio con 6 tratti transmembrana (S1-S6)

-         Segmento S4àsensore di voltaggio con 8 cariche positive (Arg)

-         S1-S2-S3àalfa-eliche

-         S5-S6àidrofobici

-         S4àmantenimento in posizione del potenziale negativo della cellula e quando si ha depolarizzazioneàslittamento verso l’esternoàpiccole correnti e ruota a spirale di 60°àmutamento conformazionaleàapertura

-         Modulazione in senso positivo e negativo con cAMP, PKC, PKA, IP3, Ca⁺²

-         Inattivazione: chiusura canale indipendente da ddp; il cancello è il segmento citoplasmatico tra dominio 3 e 4

-         F modulano canale non l’apertura (ddp); anestetici locali, antiaritmici, anticonvulsivanti, tossine

TOSSINE INIBITORIE:

-         tetradotossina (pesce palla)àblocca tutti i canali Na⁺

-         saxitossina (dinoflagellati)àblocca tutti i canali del Na⁺

FARMACI:

-         lidocaina, benzocainaà bloccano apertura canaleàblocco depolarizzazioneàno-conduzione

-         anestetici locali: molecole cariche entrano se il canale è attivato e si legano all’interno; le molecole non cariche attraversano il bilayer e raggiungono il sito d’azione dall’interno e si legano in prossimità del cancello M

-         antiaritmici (chinidina)àbloccano canali Na⁺ cardiaci e agiscono su cellule depolarizzante (danneggiate) e non alterano le altre

-         anticonvulsivanti (carbamazepine)àinibiscono canali Na⁺-voltaggio dipendenti

-         neuroprotettiviàper ischemia, ictus, blocco canali Na⁺ nelle prime fasi dell’ischemia (flunarizina), blocco overload di Na⁺àrisparmio ATPàmantengo gradiente ioniàdiminuzione rigonfiamento cellulare.

OMEOSTASI Ca⁺² INTRACELLULARE:

Il Calcio influisce sul potenziale di membrana e in cellula è presente ad una concentrazione di 10^{-7 M, mentre all’esterno è di circa 10-3 M. Il Calcio all’interno della cellula è legato a molecole nel citosol o in organuli dove può essere legato o libero (quest’ultimo è quello funzionale).}

MEMBRANA PLASMATICAàCANALI AL Ca⁺²:

VOCC:

-         operati da voltaggio, apertura dovuta a ddp

-         bersaglio di F Ca-antagonisti

-         si trovano in neuroni, fibre muscolari scheletriche, cellule endocrine, gliali, fibre muscolari lisce, fibroblasti

ROCC:

-         operati da Recettore, apertura attivata da agonista (gly, glu, Ca⁺², IP3)

-         sottotipo R per gli aa eccitatori sensibile a NMDA e molto permeabile al Ca⁺²

-         sottotipi R neuronali di AchR molto permeabili al Ca⁺²

SMOCC:

-         operati da Secondo Messaggero

-         dipende dai R accoppiati a G-proteineàfosfolipasi CàIP3

-         rilascio di Ca⁺² da organuli intracellulari sensibili a IP3

-         si trovano in cellule nervose e neuroendocrine

SDCC:

-         Store Dependent Ca⁺² Channel

-         Sensibili a messaggero retrogrado che si origina da depositi cellulari a rapido scambio che si svuotano

-         Si trovano in quasi tutte le cellule

POMPE E TRASPORTATORI:

-         estrusione Ca⁺² attraverso membrana per mantenere giusta la concentrazione di Ca⁺²

-         POMPA al Ca⁺²: si trova in membrana, consuma ATP, espelle 1 molecola di Ca⁺² ed è modulata da calmodulina che lega 4 Ca⁺² che si legano al sito regolatorio della pompa e aumenta la Vmax

-         Se l’aumento di Ca⁺² è maggiore allora si attiva lo SCAMBIATORE Ca⁺²/Na⁺ che è un antiporto, ha poca affinità ma alta capacità, espelle 1 molecola di Ca⁺² e internalizza 3 molecole di Na⁺ (la carica in più serve a controbilanciare) e questo sistema dipende dal gradiente di Na⁺ generato dalla Na⁺/K⁺-ATPasi

-         F che bloccano la pompa Na⁺/K⁺-ATPasi sono i glucosidi cardioattivi che permettono accumulo di Ca⁺² nel reticolo sarcoplasmatico e producono un effetto inotropo positivo.

ORGANULI INTRACELLULARI:

RETICOLO ENDOPLASMATICOànel muscolo si specializza in sarcoplasmatico con proteine responsabili di accumulo, deposito, liberazione di Ca⁺².

POMPA al Ca⁺²:

-         ATPasi

-         SERCA (Sarcoplasmic Reticulum Endoplasmic Ca⁺²-ATPasi)

-         2 ioni Ca⁺² / 1 ATP

-         Non regolata da calmodulina

PROTEINE LUMINALI LEGANTI Ca⁺²:

-         famiglia delle calsequestrine espresse dalle fibre muscolari

-         legano grosse quantità di Ca⁺²

-         bassa affinità per consentire il rilascio

CANALI IONICI:

-         comunicazione tra il lume dell’organulo e il citosol

-         sensibili a rianodina (tipo 1 a livello muscolare; tipo 2 a livello cardiaco e SNC; tipo 3 in vari tessuti). La rianodina denominata CIRC (Ca⁺² Induced Ca⁺² Release), cADP-ribosio agisce come secondo messaggero; la caffeina attiva il canale e la rianodina impedisce la chiusura

-         sensibili a IP3

-         IP3 è attivatore

-         ATP e Ca⁺² sono modulatori allosterici

Il nucleo segue la [Ca⁺²] del citoplasma

L’apparato di Golgiàsecerne vescicole con grandi quantità di Ca⁺²

MITOCONDRI:

-         ddp di circa -200mV a cavalo della membrana interna e il ddp è la forza di trazione per i trasporti

-         si la concentrazione di Ca⁺² aumenta, il gradiente può dissiparsiàprecipitano come fosfati di Ca⁺²

Organuli:

-         la concentrazione di Ca⁺² varia a seconda delle funzioni (proteine, attivatore enzimi, trascrizione eduplicazione DNA, espressione di geni, attiva enzimi limitanti Krebs nei mitocondri)

-         calciosomi

CITOSOL:

Meccanismi di regolazione positivaàinflusso dall’esterno e rilascio da depositi cellulari

Meccanismi di regolazione negativaàestrusione dalla cellula e accumulo in organuli

STIMOLO: l’agonista si attacca al R accoppiato a PLCàIP3 e contemporaneamente entra Ca⁺² da SMOCCàIP3 induce rilascio Ca⁺² dai depositi dotati di R specificià[Ca⁺²] decade per l’azione di rimozione delle SERCA e pompe/trasportatori della membrana ma è ancora elevata a causa di SMOCC e SDCC attivati da un segnale (CIF – anionico) generato da depositi svuotati. Grazie alla SERCAàricarica dei depositi.

PROTEINE LEGANTI Ca⁺²:

-         proprietà tampone del citosol

-         motivo strutturale comune: EF-HANDàlega il Ca^{+2 in modo selettivo e ad alta affinità}

-         calmodulinaàsubunità regolativa Ca⁺²-dipendente di alcuni enzimi

-         troponina (contrazione muscolare); calpaina (proteasi intracellulare attivata da Ca⁺²)

-         annessine: famiglia che lega Ca⁺² insieme a fosfolipidi (fosfatidilserina)

Data la lentezza di diffusione del Ca⁺² nel citosol, gli ioni possono saturare rapidamente il potere Ca⁺² tampone di quella piccola zona di citosol circostante il canale formando microterritori con alta [Ca⁺²]. Sono zone strategiche come le zone attive della membrana presinaptica dove avviene la fusione (esocitosi Ca⁺² dipendente) delle vescicole. Inoltre a causa di questa lentezza di diffusione nel citosol ci sono organuli a rapido scambio di Ca⁺² e la loro attivazione da parte di IP3 è sincrona.

PATOLOGIE LEGATE AL Ca⁺² CELLULARE:

-         mitocondri, citoscheletro, membrane

-         eccitotossicità nei neuroni

-         morte cellulareàattivazione enzimi litici Ca⁺²-dipendenti

FARMACOLOGIA:

Ca⁺²-ANTAGONISTI:

-         si oppongono all’apertura del canale

-         effetto sinergico tra loro

-         antiipertensivi, antiaritmici, antianginosiàcanali L

-         diidroperidine agiscono a livello vascolare selettive per le coronarie

-         fenilalchilamine (verapamil) agiscono a livello cardiaco e bloccano VOCC

-         benzotiazepine

-         questi F hanno interazione allosterica

-         BAYK8466àaperiente canale Ca⁺²

AZIONE VASCOLARE:

-         aumento Calcio intracellulareàCa⁺²-calmodulinaàattivazione miosinaàinterazione con actinaàcontrazione

-         Ca⁺²-antagonisti inibiscono entrata di Ca⁺²àvasodilatazione arteriosa (non venosa), antiipertensivi, vasodilatanti, antianginosi

AZIONE CARDIACA:

-         aumento Calcio intracellulareàCa⁺²-troponinaàinterazione actina-miosinaàcontrazione

-         Ca⁺²-antagonisti hanno effetto isotropo negativoàblocco canali VOCC a livello del nodo del seno, nodo atrio-ventricolare delle fibre di conduzione, rallentato ritmo pace-maker del nodo del seno, antiaritmici

EFFETTI COLLATERALI:

-         associati a vasodilatazione periferica

-         diidroperidine: ipotensione, cefalea, nausea, edemi periferici o polmonari

-         effetto negativo sistema endocrino

-         nuovo utilizzo Ca⁺²-antagonisti nelle cefalee e vasospasmo

TOSSINE:

-         Cu-conotossina: veleno di alcune lumache di mare, attivo sui canali N

-         Cu-agatossina: veleno di alcuni ragni attivo sui canali P

CANALI Tà responsabili eccitabilità (contrazione, secrezione ormoni e neurotrasmettitori)

-         BASSA SOGLIA: aprono in risposta a piccole depolarizzazioni, si inattivano velocemente, controllano eccitabilità cellulare e attività ritmica di cellule muscolari e neuronali

-         ALTA SOGLIA: aprono con grosse depolarizzazioni, si inattivano lentamente, responsabili dell’aumento della concentrazione di Ca⁺² necessario perché agisca da secondo messaggero

VOCC:

-         T (transiente)

-         L

-         N (neuronale)

-         P (Purkinje) 

RECETTORI PER AA ECCITATORI:

Glutammato:

-         neurotrasmettitore coinvolto in apprendimento, memoria, controllo sensoriale e in patologie come le convulsioni, invecchiamento, degenerazione neuronale

-         aa più abbondante del SNC e siccome la BEE è impermeabile al Glu, allora deve essere sintetizzato in loco

-         si trovano nel cervello, cellule gliali e neuronali, ippocampo, corteccia, cervelletto, striato, talamo e soprattutto telencefalo

-         il Glu è liberato in maniera Ca⁺² dipendente da terminali neuronali in seguito a depolarizzazione

-         5 cDNA che codificano per proteine trasportatrici del Glu e differiscono tra loro per la distribuzione tissutale e affinità per il Glu

RECETTORI:

IONOTROPI: complessi polimerici da 4-5 subunità ciascunoà canale ionico transmembrana

1)      AMPA:

-         R per l’acido α-amino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazol-propionico

-         Costituito dalle subunitààGluRA, GluRB, GluRC, GluRD

-         Cinetiche di attivazione e desensitizzazione rapide

-         Permeabili a Na⁺ e poco al Ca⁺² (permeabili al Ca⁺² se manca GluRB)

-         Si trovano in membrana postsinaptica e sono responsabili della risposta eccitatoria (depolarizzazione)

-         Kainatoàinteragisce con questi Ràalterazioni omeostatiche e depolarizzazioni lunghe

-         Q/R dell’M2àR: impermeabile a ioni Ca⁺²

-         Il gene che codifica per GluRB contiene il codone per Q nel sito Q/R ma l’mRNA codifica per RàEDITING dell’mRNA

-         Flip: proteina sempre espressa in neuroniàinattivazione lenta

-         Flop: proteina espressa tardivamente e insieme a Flipàinattivazione veloce

2)      KAINATO:

-         R per il kainato

-         Costituito dalle subunitààGluR5, GluR6, GluR7, KA1, KA2

-         Permeabile a Na⁺ e /o K⁺

-         GluR5 e GluR6àQ/R sia Q che R e GluR6à2 editing in M1à 8 mRNA

-         Si trova nei neuroni pre e postsinaptici

3)      NMDA:

-         R per N-metyl-D-Aspartato

-         Costituito dalle subunitààNR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D

-         Cinetiche lente, può essere bloccato dall’interno con F ma diffondono poco nel SNC

-         Permeabile a ioni solo con depolarizzazione (blocco da Mg⁺²)

-         Richiede 2 neurotrasmettitori: Glu e Gly (cotrasmettitore) per essere attivato

-         Permeabile al Ca⁺²

-         NR1àdiverse forme di splicing-_>diverse proprietà

-         NR2àdiverse formeàdiverse caratteristiche elettrofisiologiche

-         Q/Rà N (Asparagina) del M2àalta permeabilità al Ca⁺² e blocco Mg⁺²

-         Si trova nelle membrane postsinaptiche

-         Agonisti o antagonisti del sito della Gly favoriscono o meno attività NMDAàanticonvulsivante

CARATTERISTICHE MOLECOLARI RECETTORIALI:

R METABOTROPI:

-         mGluR

-         porzione X (partecipa alla regione per riconoscere Glu) analoga a LIVBP (Lue/Ile/Val-binding-protein) e presente anche in iGluR

-         porzione S1 ricca di Cys che precede la prima α-elica

-         M1-M7à7 territori transmembrana

-         C-ter intracellulare

R IONOTROPI:

-         iGluR

-         Porzione X

-         S1 e S2 analoghi a proteine batteriche periplasmatiche QBP (Glutamine Binding Protein)

-         LAOBP e PhosBPàsito di legame per Glu

-         S1 e S2àanalogie anche con KBP (Kainato Binding Protein)

-         M1-M4à4 regioni transmembrana, M2àsito Q/R per selezionare ioni e ricorda il tratto P degli altri recettori canale

FARMACOLOGIA dei mGluR:

-         neuroprotezione

-         controllo movimento

-         attacchi epilettici

-         modulazione iGluR

-         bersaglio per regolare tono eccitatorio

R-NMDAàsbloccato da Mg⁺² per funzionare

R-AMPA e KAINICOàinducono depolarizzazione necessaria a R-NMDA

Ogni Ràfenomeni di plasticità neuronale

METABOTROPI:

-         si trovano in neuroni e glia

-         processi sinaptici lenti

-         azione mediata da G-proteine

-         agonista selettivoàACPD

-         7 domini M e grosso N-terminale

-         M3 e M4àsequenze per attivare le G-proteine

-         C-terminaleàsequenze per fosforilazione

-         Memoria e apprendimento

-         Processi anche ionotropi

3 CLASSI:

1°àmGluR1 e mGluR5àaumentano PLC

2°àmGluR2 e mGluR3àdiminuiscono AC

3°àmGluR4 e mGluR6/7/8àdiminuiscono AC

PATOLOGIE:

-         AIDS: una proteina del virus attiva NMDA-R

-         Epilessia: aumenta sensibilità al Glu e aumenta numero di R

-         Schizofrenia: toglie tono eccitatorio

-         ICTUS: eccesso di Gluàchiusura vaso sanguigno.. Senza ossigeno e glucosioàno irrorazione dei neuroni. Secrezione di GluàNMDA-Ràpassaggio di Na⁺ e Ca⁺² e richiamo di acqua in cellula. Inversione scambiatore Na⁺/Ca⁺²àaccumulo di Ca^{+2 in cellula. Degradazione fosfolipidi, per ossidazione}àespansione fenomeno ischemico. Morte neuronale.

INTERVENTI:

-         ridurre liberazione Glu con fattori che stimolano R per Adenosina

-         inibizione sintesi neurotrasmettitore

-         diminuzione temperatura cerebrale

-         somministrazione antagonisti di Glu

-         antagonisti Ca⁺²VOCC (diidroperidine, ma attivi solo su L)

-         inibire PKC

Gli AGONISTI dei R per gli aa eccitatori vengono assunti con la dieta e possono causare Sclerosi Laterale Amiotrofica.

PLASTICITA’ NEURONALE:

Capacità di modificare il SNC nel corso della vita con le esperienze, l’apprendimento e la memoria.

APPRENDIMENTOàprocesso attraverso il quale si acquisiscono nuove conoscenze

MEMORIAàl’apprendimento diventa memoria; nell’ippocampo e strutture libiche; acquisizione stabile e consolidata a breve termine (procedurale) o a lungo termine (associativa)

PLASTICITA’ài neuroni possono accrescersi o ridursiàmodificazione afferente-efferenze in funzione di stimoli locali. Coinvolge le SINAPSI.

1949 – Hebbàla sinapsi è sede critica della modificazione (sipatica) plastica e la memoria è la variazione persistente nel rapporto fra neuroni (struttura e biochimica).

1976 – Kandel:

-         studia Aplasia (lumaca di mare)àriflesso monosinaptico

-         abitudine, sensibilizzazione, condizionamento

-         getto d’acqua sul sifone della lumacaàcontrazione branchia

-         il getto arriva sui meccanocettori presenti sul sifoneàneuroni sensorialiàsinapsi con motoneuroniàcontrazione

-         ABITUDINE: più volte l’esperimento a intervalli di tempo regolariàprima risposta forteàmemoriaàsuccessive più deboli