GFP

GREEN FLUORESCENT PROTEIN

GFP è una proteina fluorescente (di 238 aa) isolata dai celenterati come la medusa del Pacifico A. victoria. Il suo ruolo è quello di trasdurre la chemioluminescenza blu della proteina aquorina nella luce verde fluorescente tramite trasferimento di energia. Il gene per la GFP è stato isolato ed è diventato un tool molto utile per creare proteine chimeriche di GFP fuse con altre proteine in cui la sua funzione è quella di "etichetta" fluorescente. La GFP tollera fusioni alle estremità N e C terminale con una vasta gamma di proteine. Viene espressa in batteri, lievito, piante, drosophila, zebrafish e in cellule di mammifero. Essendo un marker fluorescente non-invasivo in cellule viventi, la GFP è impiegata in un vasto raggio di applicazioni in cui può fungere come reporter di espressione genica, come marker per diversi processi cellulari (apoptosi) o come una misura delle interazioni proteina-proteina.

Spettro di fluorescenza della GFP

La proteina GFP wild-type della medusa presenta due picchi di eccitazione: uno maggiore a 395 nm e uno minore a 475 nm. Il suo picco di emissione è a 509 nm nel "basso" verde della porzione dello spettro visibile.

La GFP esibisce solo un picco maggiore di eccitazione a 498 nm. Alcuni mutanti del gene della GFP sono stati prodotti e presentano anche un'intensità di fluorescenza maggiore. Il picco di eccitazione è stato ottimizzato a 490 nm e quello di emissione a 509 nm e questo consente un miglior uso con i filtri ottici. I mutanti GFP comunque hanno un range molto compatibile con i più comuni filtri ottici. Questo inoltre è molto utile per le applicazioni che impiegano la microscopia confocale, a fluorescenza e di tipo "Time-Lapse". Alcuni varianti GFP sono:

BFP (Blue Fluorescent Protein)

CFP (Cyan Fluorescent Protein)

YFP (Yellow Fluorescent Protein)

RFP (Red Fluorescent Protein)

Il fluoroforo della GFP

Nella GFP il fluoroforo ha origini nella sequenza Ser-Tyr-Gly che viene post-tradotta a 4-(p-hydroxybenzylidene)- imidazolidin-5-one. Il fluoroforo in sè è un p-hydroxybenzylidene-imidazolidone che consiste di residui Ser65- dehydroTyr66 - Gly67 della proteina il quale scheletro ciclico forma l'imidazolidone. La fluorescenza non è una fluorescenza intrinseca del tripeptide Ser-Tyr-Gly ma questa è dovuta probabilmente a due ragioni:

- una parziale carica negativa sull'ossigeno benzile della Tyr

- una carica sull'ossigeno carbonile dell'anello imidazolidonico

Nella struttura a 3D della GFP alcuni residui basici formano legami H con ognuno di questi atomi di ossigeno e in particolare:

- His148 con Tyr66

- Gln94 e Arg96 con l'imidazolidone

Questi residui basici agiscono per stabilizzare e successivamente delocalizzare la carica sul fluoroforo. Il fluoroforo è generato da un meccanismo sequenziale in un processo autocatalitico. Non sono richiesti cofattori o componenti enzimatici. La reazione ha inizio con una rapida ciclizzazione tra Ser65 e Gly67 a formare un intermediario imidazolin-5-one seguito da una più lenta ossigenazione della Tyr66 della catena laterale da un O₂ della durata di alcune ore. Solo la Gly67 è richiesta per la formazione del fluoroforo e nessun altro aminoacido può sostituire la Gly in questo ruolo. La reazione è termosensibile. La capacità di formazione del fluoroforo decresce con l'aumentare della temperatura in particolare al di sopra dei 30°C. Una volta formata, la GFP è abbastanza termostabile. L'ossigeno molecolare è necessario per la formazione del doppio legame tra i due atomi di carbonio sulla Tyr per formare un'estensione del sistema aromatico.

Fluorescenza dei mutanti GFP

Le varianti della GFP presentano cambiamenti nei legami deboli (Van der Waals) tra i residui della catena laterale di Thr203, Glu222, e Ile167 che sono in contatto con la Tyr66. Le mutazioni di questi residui presentano effetti sferici diretti sul fluoroforo. Le mutazioni cambiano anche l'ambiente elettrostatico se la carica varia. Inoltre i residui mutati vicini al fluoroforo hanno effetti diretti sullo spettro di emissione e assorbimento. Alcune mutazioni portano a significativi spostamenti della lunghezza d'onda e molti causano una perdita di intensità di fluorescenza.

Mutazioni puntiformi e casuali hanno portato a vari cambiamenti nel comportamento della fluorescenza, per esempio:

- mutazione di Tyr66 con Phe sposta la banda di eccitazione ma c'è una gran perdita di intensità

- mutazione di Tyr66 con Trp sposta lo spettro nel blu

- mutazione di Ser65 con Thr aumenta l'intensità di fluorescenza

- mutazione di Tyr66 con His sposta lo spettro di eccitazione nel campo UV a 383 nm e l'emissione a 448 nm nel blu

- mutazione di Ser65 con Thr, Ala, Cys o Leu causa una diminuzione del picco di eccitazione a 395 nm ed un incremento nell'eccitazione nel blu

- quando si combinano mutazioni con Ser65 e altri siti vicino al fluorofor come Val68 con Leu e Ser72 con Ala, aumenta l'intensità della fluorescenza verde prodotta da un eccitazione a 488 nm

- mutazione di Ser202 con Phe a Thr203 con Ile entrambe causano un abbassamento di eccitazione a 475 nm con mantenimento del picco di eccitaizione a 395 nm

- mutazione di Ile167 con Thr causa una reversibilità di sensibilità da 395 a 475 nm

- mutazione di Glu222 con Gly è associata ad un'eliminazione del picco di eccitazione di 395 nm

- mutazione di Val163 con Arg aumenta la temperatura di tolleranza per l'espressione funzionale della GFP

- mutazioni di His148 influiscono sulla dipendenza del pH della banda di eccitazione a 395 nm e 475 nm

- mutazioni di Phe100 con Ser, Met154 con Thr e Val164 con Ala sono difficili da spiegare sulla base della struttura

La rimozione di più di 7 aminoacidi dall'estremità C-terminale o della metionina N-terminale, causa una totale perdita di fluorescenza. Tutti i mutanti non fluorescenti non esibiscono il tipico spettro di assorbimento del fluoroforo intatto.

Qui sotto sono esposte alcune foto di esperimenti effettuati con la GFP: