PROTOCOLLI di LABORATORIO
| BIOLOGIA CELLULARE | BIOLOGIA MOLECOLARE |
| Colture cellulari | Trasfezione |
| Conta cellule | Preparazione mowiol |
| Colorazione DAPI | Conta cellulare |
| Colorazione BrdU | Elettroforesi |
| Congelamento cellule | Elettroporazione |
| Scongelamento cellule | Tabella Fluorofori |
| Analisi FACS | Estrazione DNA |
| Trasformazione plasmidica per gliceroli | Lisi cellulare |
| Maxiprep | Dosaggio proteico |
| Polylisina per 96 well | Western Blot |
| Trasfezione | Sviluppo lastre |
| Biotinilazione | |
| Pegghilazione e aliquote (piastra 10cm) | |
| Titolazione virale | |
| Buffers | |
| Terreni |
PROTOCOLLI di BIOLOGIA CELLULARE e METODICHE di LABORATORIO
TIG3 – hTert
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
293T
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
Phoenix Amphotropic
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
U2OS
TERRENO: DMEM + 10% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
MCF10A
TERRENO: 233,5ml DMEM + 233,5ml F12 + 25ml HS + 2,5ml Hydrocortisone + 5ml Insuline + 500ul Cholera Toxin (+ EGF 1:50,000 prima di passare le cellule)
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
Per 50ml di terreno-->1ul EGF
Per 40ml di terreno--> 0,8ul EGF
Per 30ml di terreno--> 0,6ul EGF
Melanociti
TERRENO: Mc Coy’s 5A with Glutamax 500ml + 10ml NA + 2,5ml Insulina + 2,5ml di Transferrina + 2,5ml di Idrocortisone + 83ul di Cholera Toxin (prima di passare le cellule preparare il terreno e aggiungere i fattori: TPA 25,000X, SCF 1000X, FGF 1000X, END 1000X)
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare delicatamente 1 volta con 5ml di PBS e buttare
- aggiungere 1,5ml di TRIPSINA e attendere in incubatore circa 50-90 secondi
- aspirare la TRIPSINA
- percuotere la plate al microscopio fino a staccare le cellule
- aggiungere 6ml di MEDIUM e raccogliere in Falcon da 50ml
- aggiungere 6ml di MEDIUM e raccogliere in Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
Dendritiche
TERRENO: 88,35ml IMDM + 45ml R1 + 15ml NA + 1,5ml PS + 150ul B-mercaptoetanolo
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e raccogliere il terreno in una Falcon da 50ml
- aggiungere alla plate 1-1,5ml di EDTA 2mM per 10 minuti
- lavare la plate con 5ml di PBS e raccogliere il tutto nella Falcon da 50ml
- lavare la plate con altri 5ml di PBS e raccogliere nella Falcon da 50ml
- centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti a +4°C (temperatura facoltativa)
- togliere il surnatante
- risospendere delicatamente il pellet con 1ml di MEDIUM R1
- mettere 90ul di Trypan-Blue in un pozzetto della 96well per la conta cellulare
- prendere 10ul della sospensione cellulare (R1 + pellet) e metterli nel 90ul per la conta (diluizione 1:10)
- mettere alcuni ul nella camera di Burker e contare 1 quadrato (4 x 4)
- calcolo: n° cells x 10 x 10,000 = cells/ml
- per piastrare 2,000,000 cells-->2,000,000 : cells/ml = ul o ml di cellule (10ml – ul o ml di cellule = ml di terreno)
Splittate il Lunedì – Giovedì oppure Martedì – Venerdì
STEM CELLS
TERRENO:
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- staccare tutte le sfere manualmente battendo la Flask sui bordi (non fare bolle)
- raccogliere tutto il terreno in Falcon da 15ml
- lavare la Flask con PBS in modo da raggiungere nella Falcon i 15ml
- centrifugare a 300rpm per 10 minuti
- togliere in surnatante con la pipetta lasciando del terreno corrispondente a circa 3-4 volte il volume del pellet
- settare la P200 a 180ul, spipettare circa 150 volte tenendo inclinata la Falcon, formando un vortice di liquido lentamente e delicatamente tenedo il puntale nel liquido per non fare bolle, ogni tanto lavare il limite più alto del vortice
- contare le cellule facendo una diluizione 1 : 2 con Trypan-Blue (8ul + 8ul), fino ad un centinaio (possono essere 4 o 5 quadrati piccoli perciò riportarli ad 1 quadrato grande e fare il calcolo: n° cells x 2 x 10,000 = n° cells/ul). Contare solo le cellule di media grandezza e traslucide
- con la pipetta quantificare il volume di terreno in cui sono contenute le cellule, quindi si moltiplica il n° di cellule per il ul
- piastrare in Flask T25, 200,000 cellule in 4ml di terreno
WM266
TERRENO: MEM + 10% NA + 1% N.E.A.A. + 1% NaP + PS, filtrare in 0.22u
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
SK-N-MC
TERRENO: MEM + 10% NA + 1% NEAA + 1% NaP + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
MDCK
TERRENO: DMEM + 10% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
HeLa
TERRENO: DMEM + 10% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
IMR-90
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
CAPAN-1
TERRENO: IMEM + 20% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
SAOS-2
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
RAW
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- aggiungere 2ml di VERSENE e attendere a 37° per circa 5 minuti
- aggiungere 4ml di MEDIUM per neutralizzare il VERSENE
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
CONTA CELLULE
- raccogliere le cellule dalla piastra e metterle in Falcon
- prelevare “x” μl di sospensione cellulare e metterla in pozzetto della 96 well
- diluire 1 : 2 oppure 1 : 4 con diluizioni seriali (1:4à25μl di cellule + 25μl di trypan blue in un pozzetto, poi da questa soluzione con diluizione 1:2 prendo 25μl e li metto in un secondo pozzetto insieme a 25μl di trypan blue in modo da avere una diluizione finale di 1:4)
- mettere 25μl (non importa il volume, occorre riempire la camera di Burker senza esagerare) in un quadrante di una Burker e contare le cellule che ci sono in 3 sottoquadranti in obliquo
- calcolo: (A+B+C) : 3 x 2 (o 4 a seconda della diluizione) x 10.000 x ml totali raccolti in Falcon
- si ottiene il numero di cellule totali della piastra e mediante proporzione è possibile calcolare quanti ml di sospensione cellulare prendere
COLORAZIONE DAPI
Metodo:
- togliere il terreno dalla pipastra
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- fissare le cellule con paraformaldeide per 10 minuti
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- colorare con DAPI (1 : 2000 in H2O) per 5 minuti
- lavare 1 volta con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- lavare 1 volta con H2O
- stendere il montante (mowiol) sul vetrino con un puntale (P20) e montare il copri-oggetto
COLORAZIONE BrdU
Metodo:
- preparare 10 ml di TERRENO con 100 µl di BrdU (1 : 100)
- togliere TERRENO dalla piastra e mettere quello preparato con BrdU per 45 minuti nell’incubatore a 37°C
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- fissare le cellule con paraformaldeide per 10-15 minuti
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- permeabilizzare le cellule con TRITON X-100 allo 0,1% (in PBS) per 10 minuti
- bloccare con BSA 2% per 30 minuti
- diluire anti-BrdU puro in PBS con (per avere 500µl totali) 100µl BrdU, 5µl DNAse, 1,5µl MgCl2, 393.5µl BSA 1% e metterlo a contatto con le cellule per 45 minuti
- lavare 3 volte con BSA 1% (o solo PBS) e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- mettere a contatto delle cellule l’Ab secondario (1 : 400) in BSA 2% per 30 minuti
- colorare con DAPI (1 : 2000) per 5 minuti
- lavare 3 volte con BSA 1% (o solo PBS)e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- stendere montante (mowiol) sul vetrino con puntale e montare il coprioggetto
CONGELAMENTO CELLULE (per 11+/+, TIG3htert, U2OS, MCF, tutte)
Metodo:
- lavare le cellule piastrate con PBS 2 volte
- tripsinizzarle per staccarle
- raccogliere in Falcon 50
- centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti
- preparare le vials per stoccaggio (1 vial/plate)
- dopo la centrifuga togliere il surnatante e risospendere in soluzione di congelamento, 1ml/plate (9 ml di siero SA + 1 ml di DMSO) mentre per le dendritiche occorrono 0.5ml. La soluzione si tiene per 10-15 giorni
- picchettare la falcon per disgregare il pellet nel liquido che rimane sul fondo
- mettere 1ml per vial di sospensione per congelamento
- mettere le vials in contenitore con isopropanolo e tenerle a -80°C per 2-3 giorni e riporle in azoto liquido
SCONGELAMENTO CELLULE (per 11+/+, TIG3htert, tutte)
- prendere dall’azoto liquido la vial e tenerla in ghiaccio secco fino a quando si deve scongelare
- scongelare rapidamente nel bagnetto a 37°C
- mettere 10ml di TERRENO caldo (37°C) in Falcon 15 e aggiungere le cellule goccia a goccia con una pipetta
- centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti
- togliere il surnatante
- risospendere il pellet in 10ml di TERRENO e piastrare (1 vial/plate) scrivendo il nome della linea, data di congelamento e scongelamento, passaggio
- per i melanocitià 1 vial/plate 6cm - 5ml
ANALISI AL FACS
Dopo la trasfezione, per verificarne l’efficienza, si possono contare il numero di cellule fluorescenti preparando i campioni nel seguente modo:
- risospendere le cellule in 1ml di TERRENO NA 10%
- centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti
- togliere il surnatante
- mettere 1ml di PBS
- centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti
- lavaggio con 1ml di PBSàrompere il pellet e centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti
- risospendere il pellet in 500µl
TRASFORMAZIONE PLASMIDICA PER GLICEROLI
Metodo:
- prendere le eppendorf con i batteri (E. coli) dal -20°C
- prendere 200ng DNA plasmidico (eventuale diluizione con H2O) e metterli in 50µl di una sospensione di cellule competenti
- tenere in ghiaccio per 30 minuti
- mettere la vial con DNA e batteri a 42°C per 45 secondi
- mettere la vial in ghiaccio per 2 minuti
- aggiungere 300µl TERRENO LB + Ampicillina nella vial
- risospendere e trasferire in Falcon 50 con puntale dentro (P200)
- mettere Falcon nello shaker a 37°C per 1 ora
- prendere 25-30µl della sospensione ottenuta e distribuirli (con il bastoncino uncinato bianco) in una piastra Petri con terreno TB + Amp (conservare la sospensione rimasta a 4°C)
- incubatore a 37°C OverNight (O.N.)
- al mattino prendere 1 colonia con il puntale dal terreno (agar) e metterla in 5ml di terreno LB + Ampicillina per tutto il giorno (conservare la piastra con le colonie rimanenti a 4°C mentre si può buttare la sospensione)
- dalla sospensione ottenuta fare i gliceroli da conservare a -80°C (500µl glicerolo + 500µl di sospensione) o fare MAXIPREP dalla quale poi si conservano i gliceroli
PREPARAZIONE DNA CON MAXIPREP
- per ogni battere preparare 1 Falcon con 5ml di terreno LB (pronto in cucina) + Ampicillina (1 : 500 à 10μl in 5ml)
- dal -80°C prendere aliquota di glicerolo per ogni battere, raccogliere glicerolocon puntale, metterlo (anche puntale) nella Falcon
- agitare OverDay a 37°C
- la sera preparare beuta con 500ml di LB e mettere tutto il contenuto della Falcon (dopo aver verificato che il terreno nella Falcon sia opaco) senza puntale e agitare O.N. a 37°C
- al mattino mettere nei contenitori da centrifuga tutto il terreno che si riesce (al livello) e centrifugare a 6000 rpm per 10 minuti e durante questo tempo conservare il terreno con i batteri in glicerolo (500µl glicerolo + 500µl di LB con coltura). Se i gliceroli si fanno dopo, mettere la beuta a 37°C in Shaker
- togliere tutto il terreno (nel lavandino) e sgocciolare rovesciando i contenitori sulla carta assorbente
- risospendere e omogenare il pellet con 10ml di soluzione P1 (a +4°C)
- aggiungere 10ml di soluzione P2, attendere 5 minuti e invertire 2/3 volte
- aggiungere 10ml di soluzione P3 (in ghiaccio), agitare manualmente e rimettere in ghiaccio per almeno 20 minuti
- centrifugare a 12000 rpm per 30 minuti e durante questo tempo riequilibrare le colonnine con 20 ml di QBT
- filtrare (con garza o siringa 30ml + filtri millipore 0.45) il surnatante con la colonna pronta
- aprire siringa da 30mlàtogliere lo stantuffoàaprire il filtroàavvitare il filtro sulla siringaàinserire nella siringa il liquido da filtrareàmettere lo stantuffoàfiltrare nelle colonnine
- lavare 2 volte la colonna con 30 ml di QC
- mettere le colonnine in Falcon 50 ed eluire con 15 ml di QF
- aggiungere nella Falcon 10.5ml di isopropanolo
- centrifugare a 6000 rpm per 60 minuti a 4°C
- togliere il surnatante e sgocciolare su carta assorbente
- aggiungere 5 ml di etanolo 70% per levare il pellet OPPURE 1ml in eppendorf da 1.5
- centrifugare a 4000/6000 rpm per 20 minuti a 4°C
- togliere il surnatante (cautela) – se non si è già passati in eppendorf farlo ora - e far asciugare sotto cappa per 5 minuti
- risospendere il pellet in TE sottocappa
- preparare eppendorf per lettura allo spettrofotometro per misurare la purezza e quantità del DNA (~ 1.6-1.7)àlavo la cuvetta di quarzoàstand byàDNAà260nmàμg/μlàfattore 250àokàno correzioneàokàcuvettaàverde
PIASTRE 96well con POLYLISINA
- preparare soluzione con polylisina con PBS 0.1%
- mettere 100μl della soluzione preparata in ogni pozzetto per 30 minuti a T.A. (temperatura ambiente)
- lavare 7/8 volte con H2O dd e lasciar asciugare sotto cappa molto bene
- plate 96well pronta per piastrare cellule da utilizzare il giorno dopo nella trasfezione (18.000 cells/well)
TRASFEZIONE (per plate da 10)
- preparare 2 soluzioni in 2 Falcon 15
- Falcon Aà10μg DNA + 5μg di pKat (no per Ecotrophic) + 72μl CaCl2 2M (il CaCl2 va messo per ultimo perché reagisce) e portare a 500μl con acqua dd (il tutto per il numero di plate)
- Falcon Bà500μl di HBS 2X (il tutto per il numero di plate)
- Spipettare la Falcon A
- Aggiungere Falcon A in Falcon B goccia a goccia (1ml/plate)
- Attendere 10 minuti a T.A.
- Mettere 4μl di clorochina per plate
- Scaduti 10 minuti mettere la soluzione A+B (1ml/plate) nelle piastre con cellule (senza togliere il terreno)
- Dopo 6 ore cambiare il terreno (contenente DNA e clorochina tossici per le cellule) con 10ml NA 10%
- Tenere le cellule in incubatore tutta notte
BIOTINILAZIONE (per plate da 10)
- al mattino aspirare bene con piastre inclinate il terreno NA 10%
- aggiungere al terreno HANKS modificato la biotina (15μl ogni 10ml; concentrazione iniziale di biotina 350mMàconcentrazione finale 500μM)
- mettere a contatto la biotina con le cellule per 30 minuti al buio
- cambiare terreno aspirando bene, con 10ml di terreno NA 10%
- incubare 4 ore a 37°C
- cambiare terreno con 5ml di NA 10% per concentrare il virus
- tenere le cellule in incubatore tutta notte (~ 18 ore)
PEGGHILAZIONE (per plate da 10)
- filtrare 5ml di terreno (che sono diventati 4.5) con virus concentrato in una Falcon (filtro da 0.45)
- 1 siringa/plateàbutto l’agoàpiastra inclinataàaspiro terrenoàmetto filtroàfiltrare nella Falcon
- Considero 4.5ml per cui aggiungo 1.6ml di PEG (4.5/2.75)
- Lasciare scendere tutto il PEG dal puntale
- Vortexare Falcon
- Mettere Falcon in Frigo O.N. a 4°C
PRECIPITAZIONE PEG ED ALIQUOTAZIONE
- centrifugare a 3000 rpm per 45 minuti a 4°C
- in questo tempo preparare le eppendorf dove stoccare il virus, i bollini per identificare le eppendorf
- togliere tutto il terreno con peg nella Falcon
- risospendere il pellet con BSA 0.1%-trealosio 50mg/ml in PBS (precedentemente preparata)
- congelare i campioni in ghiaccio secco ed etanolo 100%
- stoccarli in scatola di cartone a -80°C
TITOLAZIONE VIRALE CON INFEZIONE DI U2OS
Metodo:
- decidere quanti μl di virus (non concentrato) utilizzare per calcolare le beads che servono
- dopo aver scosso bene la bottiglietta, prelevare le beads totali stabilite e lavarle 3 volte con BSA 0.1% (utilizzare il magnete per dividere le beads dal surnatante da buttare)
- all’ultimo lavaggio dividere le beads in eppendorf secondo il numero di campioni da trattare (se 1 campioneà1 eppendorf)
- prendere aliquote di virus da utilizzare e portare a volume iniziale (quello prima della concentrazione fatta con BSA-trealosio-PBS allo stoccaggio) con terreno NA 10%
- mettere a contatto il virus con le beads per 2 ore in agitazione in camera fredda (4°C)
- dividere con il magnete le beads dal surnatante
- preparare terreno SA 10% con polibrene (1 : 1000à7 eppendorf per 7ml per 3 piastre = 21à25ml) da utilizzare per le diluizioni seriali (-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7à110μl in 990μl di SA + polybrene)
SURNATANTE:
- conservare il surnatante (virus non biotinilato) in frigo fino al momento di:
- centrifugarlo per qualche minuto (5 minuti) a 2000-3000 rpm
- diluirlo con SA 10% + polibrene
- metterlo a contatto con le cellule
- lasciare in incubatore O.N.
PELLET:
- lavare il pellet (virus biotinilato) 3 volte con terreno SA 10% (o 1 volta)
- risospendere il pellet con SA 10% al volume iniziale (prima della concentrazione fatta con BSA-trealosio-PBSà400μl)
- mettere a contatto con le cellule il virus DILUITO con SA 10% + polibrene
- agitare sul magnete per 30 minuti a T.A.
- tenere in incubatore con magnete sotto per 2-3 ore
- lasciare in incubatore O.N.
TOTALE:
- prendere una nuova aliquota e portare a volume iniziale (prima della concentrazione fatta con BSA-trealosio-PBS) con terreno SA 10%
- fare diluizione don SA 10% + polibrene
- metterlo a contatto con le cellule
- lasciare in incubatore tutta la notte
GIORNO DOPO:
- cambiare il terreno con SA 10%
DOPO 48 ORE:
- mettere antibiotico per selezionare le cellule infettate (puromicina 400Xà6well x 2ml x 3plate = 40mlà40000μl/40 = 100μl di puromicina in 40ml)
- cambiare terreno ogni 48 ore per sviluppo colonie
DOPO 15 GIORNI:
- colorare le colonie
- togliere il terreno
- lavare con 2ml PBS/well
- togliere l’eccesso di PBS rovesciando la piastra
- mettere 2ml di crystal violet/well per 10-15 minuti
- lavare sotto acqua corrente
- far asciugare le piastre tutta notte
- contare le colonie colorate e rapportarle ad 1ml
BUFFERS
BORATE BUFFER
- acido borico 48.5mM (97mM) 0.30g
- NaCl 145mM (209mM) 0.85g
- KCl 50mM (100mM) 0.37g
- Sciogliere le polveri in 40ml di acqua e portare a pH 9 con NaOH tramite rilevazione al pHmetro
- Portare a 50ml e filtrare dotto cappa con filtro da 0.2mm
PB 300mM (considerato 2X)
- sodio fosfato monobasico 0.41g
- sodio fosfato di basico 3.785g
- sciogliere le polveri in 90ml di acqua e portare a pH 8.5 con NaOH
- portare a 100ml e filtrare sotto cappa con filtro da 0.2mm
PARAFORMALDEIDE
- scaldare 50ml di PIPES BUFFER
- pesare sotto cappa 2g di paraformaldeide e scioglierla nel PIPES BUFFER CALDO
PIPES BUFFER:
- 40ml di Pipes 400mM a pH 6.8 5X
- 2ml di EGTA 500mM a pH 8 100X
- 0.4ml di MgCl2 1M 500X
- 157.6ml di acqua
BLOCKING SOLUTION
- trisma base 6.055g
- trisma HCl 7.88g
- ethanolamine 3.05g (3ml)
- sciogliere le polveri in 90ml di acqua
- portare a pH 9 con NaOH
- portare a 1 litro e filtrare sotto cappa
TERRENI DI COLTURA
TERRENO DI COLTURA “NA” PER (Phoenix, 293T, TIG3) 500ml
- DMEM
- 50ml NA (10%)
- 5ml PS (1%)
- 5ml Glutammina (1%)
TERRENO DI COLTURA “SA” PER (U2OS) 500ml
- DMEM
- 50ml SA (10%)
- 5ml PS (1%)
- 5ml Glutammina (1%)
TERRENO DI COLTURA PER D1 (dendritiche) 150ml
- 45ml R1
- 88.35ml IMDM
- 15ml NA
- 1.5ml PS
- 150ul B-mercaptoetanolo
- preparare EDTA 2mM per D1 partendo da EDTA 0.5M
- 0.5M = 500mM
- 500/2 = 250 (fattore di diluizione)
- ne voglio 20ml --> 20.000/250 = 80ul EDTA in 20ml di H2O sterile
- filtro con siringa grande e filtri 0.22
TERRENO DI COLTURA PER MCF10A 500ml
- 233.5ml DMEM
- 233.5ml F12
- 25ml HS (Horse Serum)
- 2.5ml Hydrocortisone
- 5ml Insuline
- 500ul Cholera Toxin
- prima di piastrare prepare il volume di terreno adatto e sciogliervi EGF 1:50.000 (per 30ml di terreno occorrono 0.6ul di EGF)
TERRENO DI COLTURA PER MELANOCITI 500ml
- Terreno McCoy’s 5A with GLUTAMAX
- 83ul Cholera Toxin
- 2.5ml Insuline
- 2.5ml Transferrin
- 2.5ml Hydrocortisone
- 10ml NA (alla fine ricoprire con alluminio)
- aggiungere PRIMA dell’USO IN PIASTRA:
- TPA 25.000X
- END 1.000X
- FGF 1.000X
- SCF 1.000X
TERRENO DI COLTURA COLORADO 500ml
- DMEM
- 50ml Colorado (10%)
- 5ml PS (1%)
- 5ml Glutammina (1%)
- FILTRARE il tutto
TERRENO HANKS MODIFICATO
- CaCl2 x 2H2O 184mg
- Glucosio 1mM 180.2mg
- MgSO4 x 7H2O 200mg
- KCl 400mg
- KHPO4 monobasico 60mg
- Sodio Bicarbonato 348mg
- NaCl 8g
- Sodio Fosfato dibasico x7H2O 88mg
- Sciogliere le polveri in 1 litro d’acqua e filtrare sotto cappa (0.2)
PROTOCOLLI DI BIOLOGIA MOLECOLARE
TRASFEZIONE
LIPOFECTAMINEÔ2000
|
Culture vessel |
Surface area / well |
Volume or plating medium |
DNA & dilution volume |
Lipofectamine & diluition volume |
|
96 well |
0.3 cm2 |
100 ml |
02 mg in 25 ml |
0.5 ml in 25 ml |
|
24 well |
2 cm2 |
500 ml |
0.8 mg in 50 ml |
2.0 ml in 50 ml |
|
12 well |
4 cm2 |
1 ml |
1.6 mg in 100 ml |
4.0 ml in 100 ml |
|
10 cm (plate) |
60 cm2 |
15 ml |
24 mg in 1.5 ml |
60 ml in 1.5 ml |
- A) x mg DNA in y ml OPTIMEM
- B) x ml LIPOFECTAMINE in y ml OPTIMEM e lasciare a T.A. (Temperatura Ambiente) per 5 minuti
- C) A + B e incubare a T.A. per 20 minuti
- D) aggiungere z ml/well
- E) dopo aver incubato per 3-4 ore aspiro il terreno e metto 1 ml di MEDIUM (a seconda che siano linee cellulari HeLa, U2OS, etc) e incubo per 24-48 ore in attesa del trattamento
Esempio: (per 1 well)
A) 0.4 mg DNA in 50 ml optimem
B) 0.5 ml LIPOFECTAMINE in 50 ml optimem; incubo per 5 minuti
C) A + B e incubo per 20 minuti
D) Aggiungo 100 ml/well
PREPARAZIONE MOWIOL
- aggiungere a 2.4 gr di Mowiol 4-88 (Hoechst) 6 gr di glicerolo
- mix (agitando con magnete e scaldando su piastra a 50°C)
- aggiungere 6 ml di H2O e lasciare in agitazione e scaldare per diverse ore (fino a che la soluzione appare limpida)
- aggiungere 12 ml di 0.2 M Tris (pH 8.5) e scaldare a 50°C con mix per 10 minuti
- dopo che il Mowiol si è sciolto, per rendere limpida la soluzione eventualmente centrifugare a 5.000 giri per 15 minuti
- (per la fluorescence detection aggiungere 1,4-diabozicyclo-[2.2.2]-OCTANE (dabco) al 2.5 %)
- preparare aliquote di 1 ml in eppendorf e raccoglierle in portaeppendorf con etichetta
CONTA DELLE CELLULE E TRAPIANTI
METODO GENERICO
- prendo la fiasca dall’incubatore e guardo le cellule al microscopio
- aspiro il terreno
- aggiungo PBS
- aspiro PBS
- aggiungo TRIPSINA
- aspiro tripsina
- incubo per 1 minuto circa (37°C e 5% CO2)
- riprendo la fiasca, picchietto un po’ per vedere fisicamente che le cellule si staccano (perchè sono adese)
- aggiungo terreno di crescita (a seconda della mia linea cellulare)
- prelevo 0.5 ml in un bicchierino per la conta
- agiungo 9.5 ml di ISOTON (soluzione isotonica)
- conto al computer o sulla macchina per esempio 60.000 cellule, questo valore lo moltiplico per 40 (fattore di diluizione) = 2.400.000 cellule/ml
- devo trapiantare queste cellule in (per esempio) 3 fiasche da 75 ml e in ciascuna voglio 800.000 cellule per fiasca quindi 800.000/2.400.000 = 0.3 ml/fiasca in aggiunta al terreno di crescita (certo volume a seconda della linea cellulare)
- rimetto le 3 fiasche in incubatore
ELETTROFORESI DNA
- parto da una soluzione di DNA di 1.7 mg/ml
- 500 ng (0.5 mg) – 5 mg DNA
- 2 ml Buffer (a seconda dell’enzima di restrizione)
- 0.5 ml enzima di restrizione
- (16.5) ml H2O per portare a un volume finale totale di 20 ml
- preparo 4 eppendorf (A – B – C – D) con rispettivamente: A = 1 ml DNA + 2 ml buffer + 17 ml H2O; B = 1 ml DNA + 2 ml buffer + 0.5 ml BamHI + 16.5 ml H2O; C = 1 ml DNA + 2 ml buffer + 0.5 ml XbaI + 16.5 ml H2O; D = 1 ml DNA + 2 ml buffer + 0.5 ml DdeI + 16.5 ml H2O
- peso l’AGAROSIO (a seconda della %) per esempio 1 % à 0.45 gr + 45 ml TAE
- metto il tutto in una beuta (il tampone TAE è concentrato 1 X) e scaldo a 100°C per alcuni secondi fino a che non bolle e la soluzione diventa limpida
- rinfresco con H2O fino ad abbassare la temperatura (da tenere in mano la beuta)
- aggiungo 1 ml di Bromuro di Etidio SOTTO KAPPA!!!
- preparo lo stampo del gel ( la misura è a seconda dei campioni che devo far correre) sempre sotto cappa e livello il piano dello stampo con la bolla
- vuoto la beuta nello stampo
- inserisco il pettine dei pozzetti
- aspetto 10 – 30 minuti
- tolgo il pettine e preparo il Loading Buffer: nella eppendorf con 50 ml (0.25 mg/ml) e faccio una diluizione 1:2,5 cioè 1 ml di DNA + 1,5 ml di TAE il tutto moltiplico per 50 e ottengo 50 ml DNA + 75 ml di TAE cioè un volume di 125 ml che divido per 6 (perchè il buffer è concentrato 6X) e ottengo 20.8 ml di loading buffer e (125 – (20.8 + 50 = 70.8) – 70.8 = 54.2) 54.2 ml di TAE
- prendo una vaschetta orizzontale e la riempio di TAE fino a un po’ poi inserisco il gel che ormai è solidificato e copro tutto con TAE
- metto il coperchio, inserisco i fili e inizio la corsa elettroforetica a 50 Volt per circa 1 ora (in questo caso guardo a vista perchè non deve di troppo superare la metà in quanto il Bromuro di Etidio migr in senso opposto al DNA)
- finita la corsa prendo il gel, lo guardo a UV e faccio la foto per le analisi.
ELETTROPORAZIONE
- cellule in fase esponenziale di crescita (24 h) 20 x 106 cells/ml in PBS
- mettere il plasmide da 1 a 10 mg/ml (utilizzare per la preparazione endotoxin free della Qiagen) e in seguito 0.4 ml di sospensione cellulare aggiunta nella cuvetta
- elettroporazione (HeLa 380 V 950 mF)
- cuvetta in ghiaccio per 10 minuti
- cellule in 2 fiasche piccole con terreno completo facendo attenzione a non prendere la schiuma
- dopo 24 h le cellule morte vengono tolte aggiungendo terreno fresco
- dopo 6 ore si mette antibiotico ad una concentrazione che dà il 100% di morte (se questa dose non si conosce occorre fare una dose-risposta seguendo la crescita delle cellule per alcuni giorni, dipende dall’antibiotico)
- finita la selezione in antibiotico (per G418 sono 10 giorni; della Sigma, controllare il titolo e prepararlo in PBS con Hepes 100mM alla concentrazione di 50 mg/ml, conservarlo a 20°C) procedere col clonaggio
- contare 3 cellule per pozzetto (96 well) mettere 100 ml per pozzetto (30 cell/ml)
- passare i cloni sdoppiandoli n 2 pozzetti nelle piastre da 48 well di cui una contenente i vetrini per immunofluorescenza e utilizzare questi per vedere se i cloni sono positivi la localizzazione della proteina
- western blotting dei cloni selezionati
TABELLA FLUOROFORI
Fluoroforo |
ABS max |
Emissione min |
Colore |
|
346 |
460 |
blu |
|
359 |
461 |
blu |
|
20 |
532 |
giallo |
|
489 |
506 |
verde |
|
488 |
530 |
verde |
|
498 |
516 |
verde |
|
|
550 |
570 |
rosso |
|
|
550 |
573 |
rosso |
|
|
595 |
615 |
rosso |
|
|
649 |
666 |
Far red |
|
|
647 |
670 |
Far red |
ESTRAZIONE DNA DA GEL DI AGAROSIO
- Pesare le eppendorf vuote (~1 gr)
- Tagliare con bisturi i frammenti di DNA dal gel sotto lampada UV
- Mettere i pezzetti di DNA nelle eppendor e pesarle (ricavando la tara) poi aggiungere 3 volumi di buffer QG (giallo) ogni 1 volume di gel (100 ml à 100 mg; se pesa 380 mg allora aggiungo 380 x 3 = 1140 ml)
- Incubare a 50°C per 10 minuti (mix occasionalmente)
- Controllare dopo dissoluzione che il colore sia giallo
- Aggiungere 1 volume di isopropanolo
- Mettere le colonnine QIAquick in un raccoglitore per eppendorf da 2 ml
- Inserire il DNA nella colonna e centrifugare a 13000 g per 1 minuto
- Eliminare il centrifugato, rimettere la colonna nello stesso tubo
- Aggiungere 0.5 ml di buffer QG e centrifugare a 13000 g per 1 minuto
- Eliminare il centrifugato e lavare aggiungendo 0.75 ml buffer PE e centrifugare 13000 g per 1 minuto
- Eliminare il centrifugato e centrifugare le colonnine vuote a 13000 g per 1 min
- Eliminare il centrifugato, mettere le colonnine rosa in eppendorf da 1.5 ml dopo aver tagliato a queste ultime il tappino
- Aggiungere 60 ml di H2O alle colonnine e centrifugare a 13000 g per 1 minuto
- Raccogliere il centrifugato (IMPORTANTE, C’E’ IL DNA) in una eppendorf e procede con le analisi (dosaggi, trasfezioni, ecc.)
PREPARAZIONE CELLULE PER LISI
- prendere ghiaccio nel secchio rosso
- prendere Falcon (50 ml), identificarli e metterli in ghiaccio
- prendere le piastre
- prendere gli scraper e “grattare” le cellule, rispospenderle e recuperarle tutte
- centrifugare
- preparo PBS e eppendorf (le identifico)
- terminata la centrifuga metto le Falcon in ghiaccio
- aspiro il surnatante e tengo il PELLET e rimetto in ghiaccio
- 1 ml (P 1000) PBS nelle Falcon e rimetto in ghiaccio
- prelevo PBS e PELLET e metto in eppendorf (mix 1-2 volte) e metto in ghiaccio
- centrifugare a 2500 g per 8 minuti a 4°C e poi rimetto le eppendorf in ghiaccio
- aspiro surnatante e congelo le eppendorf col pellet a –80°C
DOSAGGIO PROTEICO
- prendere 3 eppendorf e 3 couvette e le identifico
- inserire 100-200 ml di Lysis Buffer (LB) nelle precedenti 3 eppendorf incubate a –80°C col pellet
- aggiungere il LB incubo per 10 minuti
- centrifugare a 13.000 giri per 10 minuti a 4°C
- tengere il SURNATANTE (proteine) e scarto il pellet
- PBS + Bradford (5X): me ne servono 8 ml quindi (8/5 = 1.6) 1.6 di bradford + 6.4 di PBS
- Mettere 1 ml di questa soluzione in ogni mia corvette
- Mettere 2 ml del campione nelle corvette
- Agitare
- Lettura allo spettrofotometro
WESTERN BLOT
- preparare 3 eppendorf, identificarle e aliquotarle mettendo la quantità di ml trovata per avere 30 mg
- aggiungere nelle eppendorf 1 ml di antiossidante
- aggiungere “x” ml di Loading buffer (colore) 4X (1 + 3 di proteine) e mettere in ghiaccio (es. 7.48 + 1 = 8.48/4 = 2.12 ml)
- preparazione western: prendere 2 gel dalla camera fredda (12 % e 10 well)
- preparare la vaschetta grande per il western, l’incastro per i gel che va inserito poi nella vaschetta a contatto con i poli, il coperchio, il MOPS (buffer)
- aprire i gel, tolgo delicatamente i pozzetti, stacco la stringa di carta e posiziono i gel in modo che la stringa stia all’esterno dell’incastro bianco, verso il MOPS, una stringa l’opposto dell’altra
- inserire l’incastro bianco e mettere i due fermi di plastica, a forma di piramide rettangolare, stringere la vite
- inserire MOPS all’interno dei due gel fino all’orlo (ma evitando che fuoriesca) e inserire MOPS negli scomparti esterni ai gel (evitando il contatto con il MOPS interno)
- aggiungere 500 ml (0.5 ml) di antiossidante nei pozzetti e nel MOPS interno con siringa lavare i pozzetti:aspirare MOPS e sciaquare i pozzetti per 1-2 volte
- scaldare a 98°C per pochi minuti le eppendorf compresa quella con i pesi molecolari
- inizare la corsa a 200 V per 60 minuti circa
- terminata la corsa, prendo i gel e cou uno scalpello apro il loro contenitore di plastica, taglio i pozzetti e la stringa finale e metto il gel in una vaschetta con Transfer Buffer (TB)
- preparazione tank per blotting: umidificare con acqua il tank (parte superiore e inferiore)
- preparare 5/6 vaschette e le riempio con TB
- preparare la membrana di nitrocellulosa e 12 filtri (6 grandi e 6 piccoli) e immergerli uno per volta nelle vaschette con TB (prima immergo la membrana)
- mettere 6 filtri grandi (uno per volta) uno sopra l’altro e con un puntale eliminare le bolle
- mettere la membrana di nitrocellulosa
- mettere il gel
- mettere gli ultimi 6 filtri (quelli + piccoli) e asciugare eventuale acqua
- mettere il coperchio e collegare i fili
- iniziare la corsa a 60 V per circa 1 ora e 30 minuti
SVILUPPO DELLE LASTRE
- staccare i fili e aprire il tank
- prendere la membrana e metterla in vaschetta con PBST
- mettere in un’altra vaschetta il “rosso Panceau” e immergere la mebrana così da poter vedere se le proteine sono corse
- rimettere la membrana in PBST e fare 2-3 lavaggi fino a che non si è ripulita
- eliminare il PBST, segnare con una penna i punti delle bande del marker e incubare la membrana nella vaschetta con latte (dry milk 5% della Biorad + PBST; 25 g di latte in 500 ml di PBST) per 1 ora in agitazione
- preparare 20 ml di latte e inserire Ab 1° (Caspasi 3; PARP) con apposita diluizione (1:2000; 1:500) e incubare in agitazione la membrana con questa soluzione a 4°C overnight
- riprendere la vaschetta ed eseguire 3-4 lavaggi con PBST di 5 minuti ognuno
- preparare 20 ml di latte con Ab 2° con apposita diluizione (anti Mouse; anti Rabbit) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora in agitazione
- eliminare latte, fare un prelavaggio con PBST e incubare la membrana con PBST per 1 ora a temperatura ambiente in agitazione
- preparare una soluzione per la reazione di chemioluminescenza (ad es. 6 ml + 6 ml) in una provetta e mischiare
- prelevare, in questo caso, 6 ml da mettere sulla membrana (che poggia sul domopak) e 6 ml su una seconda membrana e attendere 3 minuti
- prendere la membrana delicatamente con la pinzetta e metterla in un foglio trasparente e mettere il tutto nel cofanetto scuro
- nella camera oscura al buio con luce rossa preparare 3 vaschette con 3 soluzioni (liquido di sviluppo, acqua, licquido fissativo) e preparare la lastra da mettere nel cofanetto scuro e lasciare in esposizione per circa 1 minuto
- aprire cofanetto e mettere la lastra nel liquido di sviluppo e agitare per qualche minuto, passare la lastra in acqua e metterla nel fissativo per qualche minuto poi ripassarla in acqua e farla asciugare.
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