PROTOCOLLI di LABORATORIO
| BIOLOGIA CELLULARE | BIOLOGIA MOLECOLARE |
| Colture cellulari | Trasfezione |
| Conta cellule | Preparazione mowiol |
| Colorazione DAPI | Conta cellulare |
| Colorazione BrdU | Elettroforesi |
| Congelamento cellule | Elettroporazione |
| Scongelamento cellule | Tabella Fluorofori |
| Analisi FACS | Estrazione DNA |
| Trasformazione plasmidica per gliceroli | Lisi cellulare |
| Maxiprep | Dosaggio proteico |
| Polylisina per 96 well | Western Blot |
| Trasfezione | Sviluppo lastre |
| Biotinilazione | |
| Pegghilazione e aliquote (piastra 10cm) | |
| Titolazione virale | |
| Buffers | |
| Terreni |
PROTOCOLLI di BIOLOGIA CELLULARE e METODICHE di LABORATORIO
TIG3 – hTert
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
293T
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
Phoenix Amphotropic
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
U2OS
TERRENO: DMEM + 10% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
MCF10A
TERRENO: 233,5ml DMEM + 233,5ml F12 + 25ml HS + 2,5ml Hydrocortisone + 5ml Insuline + 500ul Cholera Toxin (+ EGF 1:50,000 prima di passare le cellule)
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
Per 50ml di terreno-->1ul EGF
Per 40ml di terreno--> 0,8ul EGF
Per 30ml di terreno--> 0,6ul EGF
Melanociti
TERRENO: Mc Coy’s 5A with Glutamax 500ml + 10ml NA + 2,5ml Insulina + 2,5ml di Transferrina + 2,5ml di Idrocortisone + 83ul di Cholera Toxin (prima di passare le cellule preparare il terreno e aggiungere i fattori: TPA 25,000X, SCF 1000X, FGF 1000X, END 1000X)
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare delicatamente 1 volta con 5ml di PBS e buttare
- aggiungere 1,5ml di TRIPSINA e attendere in incubatore circa 50-90 secondi
- aspirare la TRIPSINA
- percuotere la plate al microscopio fino a staccare le cellule
- aggiungere 6ml di MEDIUM e raccogliere in Falcon da 50ml
- aggiungere 6ml di MEDIUM e raccogliere in Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
Dendritiche
TERRENO: 88,35ml IMDM + 45ml R1 + 15ml NA + 1,5ml PS + 150ul B-mercaptoetanolo
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e raccogliere il terreno in una Falcon da 50ml
- aggiungere alla plate 1-1,5ml di EDTA 2mM per 10 minuti
- lavare la plate con 5ml di PBS e raccogliere il tutto nella Falcon da 50ml
- lavare la plate con altri 5ml di PBS e raccogliere nella Falcon da 50ml
- centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti a +4°C (temperatura facoltativa)
- togliere il surnatante
- risospendere delicatamente il pellet con 1ml di MEDIUM R1
- mettere 90ul di Trypan-Blue in un pozzetto della 96well per la conta cellulare
- prendere 10ul della sospensione cellulare (R1 + pellet) e metterli nel 90ul per la conta (diluizione 1:10)
- mettere alcuni ul nella camera di Burker e contare 1 quadrato (4 x 4)
- calcolo: n° cells x 10 x 10,000 = cells/ml
- per piastrare 2,000,000 cells-->2,000,000 : cells/ml = ul o ml di cellule (10ml – ul o ml di cellule = ml di terreno)
Splittate il Lunedì – Giovedì oppure Martedì – Venerdì
STEM CELLS
TERRENO:
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- staccare tutte le sfere manualmente battendo la Flask sui bordi (non fare bolle)
- raccogliere tutto il terreno in Falcon da 15ml
- lavare la Flask con PBS in modo da raggiungere nella Falcon i 15ml
- centrifugare a 300rpm per 10 minuti
- togliere in surnatante con la pipetta lasciando del terreno corrispondente a circa 3-4 volte il volume del pellet
- settare la P200 a 180ul, spipettare circa 150 volte tenendo inclinata la Falcon, formando un vortice di liquido lentamente e delicatamente tenedo il puntale nel liquido per non fare bolle, ogni tanto lavare il limite più alto del vortice
- contare le cellule facendo una diluizione 1 : 2 con Trypan-Blue (8ul + 8ul), fino ad un centinaio (possono essere 4 o 5 quadrati piccoli perciò riportarli ad 1 quadrato grande e fare il calcolo: n° cells x 2 x 10,000 = n° cells/ul). Contare solo le cellule di media grandezza e traslucide
- con la pipetta quantificare il volume di terreno in cui sono contenute le cellule, quindi si moltiplica il n° di cellule per il ul
- piastrare in Flask T25, 200,000 cellule in 4ml di terreno
WM266
TERRENO: MEM + 10% NA + 1% N.E.A.A. + 1% NaP + PS, filtrare in 0.22u
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
SK-N-MC
TERRENO: MEM + 10% NA + 1% NEAA + 1% NaP + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
MDCK
TERRENO: DMEM + 10% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
HeLa
TERRENO: DMEM + 10% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
IMR-90
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
CAPAN-1
TERRENO: IMEM + 20% SA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
SAOS-2
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- pre-lavaggio con 1ml di TRIPSINA e buttare
- aggiungere 1ml di TRIPSINA e attendere a T.A. per circa 2 minuti
- aggiungere 5ml di MEDIUM per neutralizzare la TRIPSINA
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
RAW
TERRENO: DMEM + 10% NA + 1% Glu + 1% PS
MORFOLOGIA: Adese
METODO:
- aspirare e buttare terreno
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- lavare con 5ml di PBS e buttare
- aggiungere 2ml di VERSENE e attendere a 37° per circa 5 minuti
- aggiungere 4ml di MEDIUM per neutralizzare il VERSENE
- raccogliere in Falcon da 50ml
- lavare la plate con 6ml di MEDIUM e raccogliere nella Falcon da 50ml
- preparare 2 o più plate da 10cm scrivendo sul bordo Linea, Diluizione, PDL, data
- preparare il MEDIUM nelle 2 o più plate con diluizione 1:X
- 12 : X = Yml di cellule
- 10 – Y = Kml di terreno
- eseguire un movimento a croce
- incubare a 37°C, 5%CO2 con movimento a croce
CONTA CELLULE
- raccogliere le cellule dalla piastra e metterle in Falcon
- prelevare “x” μl di sospensione cellulare e metterla in pozzetto della 96 well
- diluire 1 : 2 oppure 1 : 4 con diluizioni seriali (1:4à25μl di cellule + 25μl di trypan blue in un pozzetto, poi da questa soluzione con diluizione 1:2 prendo 25μl e li metto in un secondo pozzetto insieme a 25μl di trypan blue in modo da avere una diluizione finale di 1:4)
- mettere 25μl (non importa il volume, occorre riempire la camera di Burker senza esagerare) in un quadrante di una Burker e contare le cellule che ci sono in 3 sottoquadranti in obliquo
- calcolo: (A+B+C) : 3 x 2 (o 4 a seconda della diluizione) x 10.000 x ml totali raccolti in Falcon
- si ottiene il numero di cellule totali della piastra e mediante proporzione è possibile calcolare quanti ml di sospensione cellulare prendere
COLORAZIONE DAPI
Metodo:
- togliere il terreno dalla pipastra
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- fissare le cellule con paraformaldeide per 10 minuti
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- colorare con DAPI (1 : 2000 in H2O) per 5 minuti
- lavare 1 volta con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- lavare 1 volta con H2O
- stendere il montante (mowiol) sul vetrino con un puntale (P20) e montare il copri-oggetto
COLORAZIONE BrdU
Metodo:
- preparare 10 ml di TERRENO con 100 µl di BrdU (1 : 100)
- togliere TERRENO dalla piastra e mettere quello preparato con BrdU per 45 minuti nell’incubatore a 37°C
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- fissare le cellule con paraformaldeide per 10-15 minuti
- lavare 2 volte con PBS e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- permeabilizzare le cellule con TRITON X-100 allo 0,1% (in PBS) per 10 minuti
- bloccare con BSA 2% per 30 minuti
- diluire anti-BrdU puro in PBS con (per avere 500µl totali) 100µl BrdU, 5µl DNAse, 1,5µl MgCl2, 393.5µl BSA 1% e metterlo a contatto con le cellule per 45 minuti
- lavare 3 volte con BSA 1% (o solo PBS) e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- mettere a contatto delle cellule l’Ab secondario (1 : 400) in BSA 2% per 30 minuti
- colorare con DAPI (1 : 2000) per 5 minuti
- lavare 3 volte con BSA 1% (o solo PBS)e togliere l’eccesso rovesciando la piastra
- stendere montante (mowiol) sul vetrino con puntale e montare il coprioggetto
CONGELAMENTO CELLULE (per 11+/+, TIG3htert, U2OS, MCF, tutte)
Metodo:
- lavare le cellule piastrate con PBS 2 volte
- tripsinizzarle per staccarle
- raccogliere in Falcon 50
- centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti
- preparare le vials per stoccaggio (1 vial/plate)
- dopo la centrifuga togliere il surnatante e risospendere in soluzione di congelamento, 1ml/plate (9 ml di siero SA + 1 ml di DMSO) mentre per le dendritiche occorrono 0.5ml. La soluzione si tiene per 10-15 giorni
- picchettare la falcon per disgregare il pellet nel liquido che rimane sul fondo
- mettere 1ml per vial di sospensione per congelamento
- mettere le vials in contenitore con isopropanolo e tenerle a -80°C per 2-3 giorni e riporle in azoto liquido
SCONGELAMENTO CELLULE (per 11+/+, TIG3htert, tutte)
- prendere dall’azoto liquido la vial e tenerla in ghiaccio secco fino a quando si deve scongelare
- scongelare rapidamente nel bagnetto a 37°C
- mettere 10ml di TERRENO caldo (37°C) in Falcon 15 e aggiungere le cellule goccia a goccia con una pipetta
- centrifugare a 1200 rpm per 5 minuti
- togliere il surnatante
- risospendere il pellet in 10ml di TERRENO e piastrare (1 vial/plate) scrivendo il nome della linea, data di congelamento e scongelamento, passaggio
- per i melanocitià 1 vial/plate 6cm - 5ml
ANALISI AL FACS
Dopo la trasfezione, per verificarne l’efficienza, si possono contare il numero di cellule fluorescenti preparando i campioni nel seguente modo:
- risospendere le cellule in 1ml di TERRENO NA 10%
- centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti
- togliere il surnatante
- mettere 1ml di PBS
- centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti
- lavaggio con 1ml di PBSàrompere il pellet e centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti
- risospendere il pellet in 500µl
TRASFORMAZIONE PLASMIDICA PER GLICEROLI
Metodo:
- prendere le eppendorf con i batteri (E. coli) dal -20°C
- prendere 200ng DNA plasmidico (eventuale diluizione con H2O) e metterli in 50µl di una sospensione di cellule competenti
- tenere in ghiaccio per 30 minuti
- mettere la vial con DNA e batteri a 42°C per 45 secondi
- mettere la vial in ghiaccio per 2 minuti
- aggiungere 300µl TERRENO LB + Ampicillina nella vial
- risospendere e trasferire in Falcon 50 con puntale dentro (P200)
- mettere Falcon nello shaker a 37°C per 1 ora
- prendere 25-30µl della sospensione ottenuta e distribuirli (con il bastoncino uncinato bianco) in una piastra Petri con terreno TB + Amp (conservare la sospensione rimasta a 4°C)
- incubatore a 37°C OverNight (O.N.)
- al mattino prendere 1 colonia con il puntale dal terreno (agar) e metterla in 5ml di terreno LB + Ampicillina per tutto il giorno (conservare la piastra con le colonie rimanenti a 4°C mentre si può buttare la sospensione)
- dalla sospensione ottenuta fare i gliceroli da conservare a -80°C (500µl glicerolo + 500µl di sospensione) o fare MAXIPREP dalla quale poi si conservano i gliceroli
PREPARAZIONE DNA CON MAXIPREP
- per ogni battere preparare 1 Falcon con 5ml di terreno LB (pronto in cucina) + Ampicillina (1 : 500 à 10μl in 5ml)