PROGRAMMA di LABORATORIO DI METODOLOGIE FARMACOLOGICHE

(in questa sezione saranno esposti i principali argomenti del programma ricordando che per avere una visione maggiormente dettagliata del corso è consigliabile studiare sui libri di testo opportuni)

Metodi di studio di farmaci in vivo: Uso dell’animale da laboratorio nella sperimentazione farmacologica; norme di buona stabulazione; cenni sulle normative CEE inerenti le GLP (Good Laboratory Practice), variabilità biologica; principi di statistica applicati alla ricerca farmacologica (scelta del campione, media, mediana, errore standard, t di Student, test U di Mann-Withney per dati non parametrici, analisi di varianza; protocolli sperimentali). Tecniche di maneggiamento e di somministrazione dei farmaci per via centrale e periferica.
Principali test per la valutazione di farmaci attivi (stimolanti e depressivi) sul sistema nervoso centrale ed autonomo (test di Irwin), di farmaci analgesici e antinfiammatori. Metodi di studio di farmaci in vitro: Significato, fondamenti, scopi e principali apparecchiature.
Allestimento di preparati in vitro di muscolatura liscia intestinale (ileo di cavia). Elaborazione statistica (curve dose-effetto, regressione lineare, coefficiente di correlazione).

(tratto dall'Università degli studi di Milano - www.unimi.it )

METODOLOGIE FARMACOLOGICHE

ANIMALI DA LABORATORIOàvivono nello stabulario che deve avere condizioni standard

STABULARIO e ORGANIZZAZIONE:

GLPà(Good Laboratory Practice): leggi codificate a livello europeo per la validità degli esperimenti e comprende la professionalità degli operatori; istruzione; formazione; direzione; documentazione prove; protocolli accurate; condizioni ambientali; caratteristiche chimiche-fisiche-nutrizionali; controllo veterinario.

Stabulario:

-         locale rettangolare dove a fianco ci sono altri locali

-         senza finestre con 12 ore di luce artificiale (12 ore di buio) per non confondere i risultati degli esperimenti con ormoni

-         materiale lavabile (es. piastrelle)

-         piani bassi (comodo per approvvigionamento cibo; carico/scarico; svantaggio per rumori)

-         piani alti (non c'è rumore traffico però stress da sibilo vento; approvvigionamento + faticoso)

Se ci sono CANI, vicino al MAGAZZENO c’è il locale cottura cibo.

GABBIE:

1) –     scatola con apertura superiore

-         fondo di segatura

-         makrolonàresina resistente a calore e detergenti

-         coperchio filo d’acciaio con 2 incavi per cibo e acqua

2) –     apertura frontale

-         sportello con scatoletta per cibo e acqua

-         taglia più grossa (conigli)

-         tutta d’acciaio

-         fondo aperto in filo d’acciaio in modo che le deiezioni cadono sotto e vengono ripulite

3) –     gabbia metabolica

-         studi di metabolismo (consumo acqua e cibo)

-         circolare

-         pavimento aperto con filo metallico, urine e feci cadono giù

-         sul fondo si ha raccolta separata urine e feci

ABBEVERAGGIO: automatico, entra un tubicino in ogni gabbia con una valvola; dispensatori H₂O

Tutte queste gabbieàSCAFFALATURA

Se il numero di animali è alto si ha competizione per cui non + di 10 ratti/gabbia

Se l’animale è da solo può essere aggressivo.

PULITURA scaffalatura:

-         se gabbia è a fondo chiuso la segatura è rimossa 1 volta al gg

-         se gabbia è a fondo apertoàcassetto

-         se gabbia è a fondo apertoàrotolo di carta che corre e viene cambiato

ANIMALI

NO: uccelli (voliera)

NO: pesci (acquari)

NO: rane (grandi vasche)

SI: MAMMIFERI di piccola taglia

Specieàpopolazione in grado di riprodursi

Ceppoàsuddivisione di specie con caratteristiche particolari

           àINBRED: stesso patrimonio genetico; per ISOLARE caratteristiche genetiche particolari

                                SHR (Spontaneuos Hypertesis Rattus) si sono isolati individui a pressione alta

                                e li si sono incrociati per 20 generazioni.

                                P/NP (Prefferring; Not Prefferring) a seconda della preferenza all’alcool

àOUTBRED: incroci non parentaliàspecie robusta

Animali TRANSGENICI:

Come alterare il genoma?

-         inserire geni (transgeni)

-         eliminare geni (Knock Out)

-         alterare geni esistenti (Knock In)

In tal modo è possibile studiare varie malattie come: arteriosclerosi; diabete mellito; cancro al colon; sclerosi multipla; artrite; Alzheimer.

C57BLàsigla animali

GBàpaese

Nimràallevatore

2àindice da 1 a 3 che indica DISPONIBILITA’ (1 = vende solo a priorità; 2 = vende animali se a disposizione; 3 = solo in accordo)

Sàindice STATO di SALUTE: G = gnotobiotici o sterili; S = Specific Pathogen Free; M = minimal disease; C = tutti gli altri.

TOPO:

-         peso 20-30 g

-         gestazione 19gg

-         figli 1-12

-         vita 2 anni

-         ceppi Swiss (albini)

RATTO:

-         peso 50-80 g

-         gestazione 21gg

-         figli 4-20

-         vita 3 anni

-         ceppi Wiscor (vivace); Fisher; Spargie-Daulery

CAVIA:

-         gestazione 68gg

-         figli 1-5

-         vita 4 anni

-         uso per farmaci antistaminici

GERBILLO:

-         gestazione 24gg

-         figli 4

-         vita 6 anni

-         manca il circolo di Willis (collega le carotidi con arterie cerebrali)

-         uso per farmaci antischemici

CRICETO:

-         gestazione 16gg

-         figli 1-12

-         vita 2 anni

-         uso per farmaci per encefalite (inoculo prioni)

CONIGLIO:

-         peso 3 Kg

-         gestazione 1 mese

-         figli 8

-         vita 3 anni

-         ceppi New Zeland; Fulvo di Borgogna; Le prato

-         Il TALIDOMIDE non aveva dato effetti teratogeni ma non era stato provato sul New Zeland

MAIALE NANO (Mini Pig):

-         gestazione 114gg

-         figli 6-15

-         vita 18-27 anni

-         uso per trapianti o nuove tecniche chirurgia

SCIMMIE:

-         vari ceppi

-         uso per sostanze abuso e memoria

CANI:

-         Beagle

-         Studi su farmacocinetica

CONDIZIONI STANDARDà

-         Temperatura di 22°C

-         Umidità 40-60%

-         Illuminazione 12 oreà350-400 LUX misurate a 1 metro dal pavimento

-         Alimentazione pellet, avena, frumento, colla di pesce, argilla, glucosio, sali

-         Le specie animali non dovrebbero essere insieme.

NORME GENERALI PER MANEGGIAMENTO ANIMALIà

-         corretta manipolazioneàbuona riuscita esperimento

-         evitare paura

-         buono stato salute animale

-         avvicinare mano sperimentatore con molta calma

-         evitare rumori improvvisi

-         per motivi di sicurezza guanti

Come prendere TOPO: lo prendo per la coda e lo appoggio sulla grigia, gli soffio sulla testa per tenerlo immobile e lo afferro dalla collottola verso il basso e cerco di prendere un buon pezzo di pelle della schiena per poi alzarlo in verticale tenendolo con la mano sinistra per la coda e la mano destra sul resto del corpo. In tal modo si lascia libero l’addome per le iniezioni.

Come prendere RATTO: mi faccio riconoscere facendogli annusare la mano e lo accarezzo 2/3 volte poi lo prendo per la coda e lo appoggio sulla griglia; con la mano destra invece lo prendo in tal modo: dito indice e medio ai due lati della testa, anulare, mignolo e pollice avvolgono il corpo; poi lo alzo in verticale come il topo facendo attenzione a lasciare lo spazio libero nell’addome per l’iniezione. Se il ratto si agita stringo leggermente di + le dita della testa.

Come prendere la CAVIA: la cavia non ha la coda ma è molto sensibile; occorre prenderla nella gabbia stringendola un po’ e poi avvicinarsela a se, coccolarla per calmarla.

Come prendere il CONIGLIO: con la mano sinistra afferro la base delle orecchie e con la destra devo prendere più pelle della zona lombare possibile. Quando lo rimetto in gabbia metto prima le zampe anteriore e poi le posteriore. ATTENZIONE ALLE ZAMPE POSTERIORI, SONO MOLTO FRAGILI.

VIE DI SOMMINISTRAZIONE FARMACI:

-         intramuscolare (muscolo coscia e ago entra in parallelo al muscolo)

-         sottocutanea (alzo pelle e metto ago nel derma)

-         endovenosa (per il ratto nella coda)

-         intraperitoneale (l’ago entra perpendicolare all’addome)

-         orale (tubicino con sonda nell’esofago, non bisogna spingere)

-         intracerebroventricolare

Alla fine della ricerca gli animali da laboratorio vengono sacrificati: MODELLI di EUTANASIAà

-         metodi fisici: colpo secco alle vertebre; immersione azoto liquido (solo per piccola taglia)

-         metodi chimici: inalazione di etere, CO, CO₂ 60%, alotano; iniezione barbiturici

IGIENE:

-         animali selvatici, scarafaggi, muffe non devono entrare in contatto

-         attenzione a visitatori occasionali

-         accurata pulizia; disinfestare; sterilizzare

-         cambio lettiere e camici

PREPARAZIONE SOLUZIONE FISIOLOGICA: NaCl 9%o = 9g/1000ml = 9g/1litro

PER INIEZIONI:

TOPOà0.1 ml ogni 10 gr (IP e IM)

RATTOà 0.5 ml ogni 100 gr (IP, OS, IM); 0.1/100gr

CAVIAà0.2 ml ogni 100 gr (SC)

TEST COMPORTAMENTALE IRWIN:

-         valutare efficacia di un F

-         visualizzare altri effetti e effetti tox

-         Irwin ne fu l’autore (1960)

-         Si basa sulle modificazioni del comportamento animale sotto effetto di un F

-         Caratterizzò una 50in di comportamenti che l’animale assume sotto determinati F

-         Noi ci basiamo su ~ 20 effetti, comportamenti

-         Test economico perché necessita dell’occhio dello sperimentatore

-         Eseguito su topi e ratti

-         Molti risultati in poco tempo

Occorrono:

-         animali

-         gabbietta media

-         spazio + grande per mettere animali in campo aperto

-         pinzetta (coda), crine (cornea), grata (forza aggruppamento), piano inclinato e panchetta (catatonia), pila (miosi, midriasi)

Come si esegue:

-         inizio con 6 animali testati per la 1° volta al mattino, altri 6 a metà giornata e altri 6 verso sera in quanto il F può interferire col ritmo circadiano.

-         Se i risultati sono simili allora sarà lo sperimentatore che deciderà quando fare gli esperimenti

-         Sostanza “x” ma non so la dose: se uso un intervallo ampio di dosiàinformazioni: non attive, attive, tossiche.

-         Come spaziare le dosi: 10mg/kg, 30, 100, 300, 1000mg/kg (1g/kg)à5 dosi per 5 animali e il 6° è per il controllo

-         Controllo: riceve il veicolo con cui è sciolto il F (di solito è soluzione fisiologica) per vedere se il veicolo può essere tox; deve avere lo stesso vaneggiamento dei trattati

-         Vie di somministrazione: orale e I.P.

-         Tempi per osservare il comportamento: 5-15-30-60’ per la via IP; per via EV al max 20-30’; per OS dopo 1-2 ore

Sintomi comportamentaliàdipendono dal SNC e dalle aree motorie

Sintomi neurologiciàdepressivo-eccitatorio e dipendono dall’integrità del SNC

Sintomi neurovegetativiàdipende dal SNA controllato dal simpatico e parasimpatico

Riflessiàdipendono dal SNC

All’interno di ogni colonna della tabella si osservano sintomi fisiologici (normalmente presenti) e patologici (normalmente non presenti) e per cui si danno dei punteggi ad esempio se è normale il punteggio è 4 e se sale va a 8 o se scende va a 0 ma ci sono anche punteggi intermedi in base al carattere osservato che vanno da 8-6-4-2-0.

Un animale che non presenta sintomo patologico ha punteggio per quel sintomo pari a 0.

Si osserva prima l’animale INDISTURBATO e poi DISTURBATO.

Animale indisturbato:

-         gabbia senza segatura

-         posizione del corpoàseduto normalmente ma con eccitante sta in verticale

-         attività locomotoria

-         esoftalmoàagisce sul SN simpatico e riguarda l’occhio infuori

-         respirazioneà~120 resp/min a seconda dei movimenti del diaframma

-         tremori

-         convulsioni

-         groomingàfisiologico (lecca le zampe e se le passa sul muso)

-         stereotipiaàsintomo ripetutoàpatologico (0 è normale)

-         piloerezioneàpelo retto

Animale disturbato:

-         nella gabbia aperta

-         risposta al toccoàeccitato o depresso

-         passivitààpatologico; prendo per la collottola e lo giro a pancia in alto e se sta fermo per 10 sec gli do 2 pti poi lo prendo per la zampa anteriore e se sta fermo per 10 sec altri 2 pti poi per la zampa posteriore e se sta fermo per 10 sec altri 2 pti.

-         Catatoniaàappoggio sul piano normale e se sta fermo per 10 sec gli do 1 punto; piano inclinato e se sta immobile per 10 sec gli do 1 punto; panchetta alta 8 cm dal pavimento e se sta per 10 sec gli do 1 punto; posizione a buddha (seduto sulla parete della gabbia)

-         Forza di aggruppamentoàappoggio l’animale sopra la grata e normalmente do punti 4 ma se ha preso benzodiazepine che sono miorilascianti, non si aggrappa.

-         Tono del corpoàflaccido/contratto: affondo pollice e indice sotto la pancia e do punti a seconda che le dita affondano o trovano resistenza

-         Riflesso cornealeàstimolo la cornea ed ottengo un riflesso di ammiccamento

-         Riflesso pinealeànel padiglione auricolare (sempre col crine come sopra) e scuote testa

-         Riflesso pinzettamento codaàdolorifico, l’animale squittisce

-         Riflesso di raddrizzamentoàprendo l’animale per la coda e lo lancio a 20 cm e vedo come ricade (normalmente on le 4 zampe dritte)

Profilo neurovegetativo:

-         colore cuteànormalmente è rosa ma con vasocostrizione è bianca e con vasodilatazione è rossa

-         diarreaàconta delle feci

-         diuresiàguardo la gabbietta se è bagnata per questo motivo non si mette la segatura

-         lacrimazione, salivazione, rinorreaàocchi bagnati, bocca bagnata e scolo nasale (patologia)

-         temperaturaàcaldo o freddo, mento a confronto il trattato col controllo

Tipi di F da iniettare:

-         barbiturici come pentobarbitalàdepressivo del SNC

-         morfinaàdepressivo, analgesico

-         metamfetaminaàeccitante

-         fisostigminaàinibitore colinesterasi (la colina aumenta e stimola il parasimpatico)

TEST STATISTICO:

-         test di MANN-WHITNEY

-         dati non parametrici

-         2 confronti: trattato e controlloàaltrimenti: test di KRUSKALL-WALLIS

-         numero i ranghi dal più piccolo al più grandeà9 punteggi

-         se ho punteggi ugualiàsommo i ranghi corrispondenti e divido per gli “0” che ho ottenuto; ad esempio: nell’R1 ho 3 zeri allora sommo i punteggi che gli avevo dato (1+2+3=6 e divido per il numero di ranghi uguale quindi divido il 6 per 3 = 2) così anche per il R2 (5+6+7+8+9=35/5=7).

-         Sommo i ranghi: R1 = 2+4+2+2 = 10 e R2 = 7+7+7+7+7= 35

-         n1 = n° trattati = 4

-       n2 = n° controlli = 5

-    applico le 2 formule:

-         come risultati ottengo: U1 = 20 e U2 = 0

-         prendo solo U più piccolo trovato (0) e lo confronto con la tabella di Mann-Whitney

-         U atteso = 0.008 = 0.8%àprobabilità dello 0.8% che ciò sia dovuto al caso e il 99.2 % che sia dovuto al F e che le 2 popolazioni sono diverse.

-         Questo test ci dice che per esempio il F è un depressivo ma non sapremo mai di che tipo

-         Il LIMITE è il 5% per cui la differenza è significativa e la accetto.

ANALGESICI

ANALGESICI:

-         F che tolgono sensazione dolorifica senza togliere la coscienza

-         Narcoticoàagisce sul SNC

-         Anestetici generali (pentobarbital) tolgono sensazione dolorifica e coscienza

-         3 gruppi di narcotici:

1)      analgesici naturaliàmorfina, dall’oppio

2)      di semisintesiàdiacetilmorfina o eroina; sostanza lipofila

3)      di sintesiàbutrenorfina; metadone: analgesico attivo per via oraleàdistacco dalla dipendenza da “buco”, invece di iniettare tende a prendere le compresse.

-         benefico effetto analgesico e numerosi effetti collateraliàdepressione SNC

-         blocco peristalsi intestinale (stitichezza)

-         miosi

-         liberazione ormoni

-         tolleranza (decremento effetto sostanza) e dipendenza (brusca interruzione provoca sindrome astinenziale e quando è di tipo eccitatorio causa vomito ecc)

Esistono sostanza antagoniste: NALOXONE.

TEST ANALGESICI:

-         indurre un piccolo dolore:

1)      termico

2)      presso rio

3)      elettrico

4)      chimico

-         accurati nel valutare la SOGLIA DI BASE dell’animale

-         attento alla quantità di stimolo che diamo all’animale

TEST QUALITATIVIàvalutare in un determinato tempo se l’animale reagisce o no ad uno stimolo (tutto o nulla)

TEST QUANTITATIVIàmisuro incremento di stimolo necessario a provocare una risposta; valuto a stimolo fisso (1 volt) l’incremento di tempo necessario ad una risposta

TEST SU STIMOLO CALORICO:

1) HOT-PLATE (piastra calda)

-         valutare reazione animale sottoposto a piastra calda 55°C

-         piastra mantenuta a T con termostato e visualizzata nel display di sinistra

-         display di destra è un cronometro

-         test quantitativo: calore fisso 55°C e valuto il tempo per la reazione

-         topo o ratto su piastra recintata

-         FUNZIONA: inserisco un ratto; nel momento in cui tocca la piastra con 4 zampe schiaccio il pedale e parte il cronometro; sta fermoàmuoveàprende le zampe e le leccaàrischiaccio il pedale e fermo cronometro

-         Trattamento con analgesicoàrifaccio esperimento

-         Esperimento 2: il tempo di reazione aumenta (10 s à minuti) ma c’è un CUT-OFF: limite al di la del quale non può eccedere: 40s.

2) TAIL-FLICK

-         coda poggia su dischetto all’interno del quale c’è una fotocellula

-         pedale

-         sinistraàintensità di calore lampada accesa (100 W)

-         destraàcronometro

-         coda copre il foro della fotocellulaàparte cronometro e accendo la lampada

-         dopo qualche secondo sente caldo e sposta bruscamente la coda, attiva la fotocellula che interrompe il circuitoàferma lampada e cronometro

-         con analgesicoàcome esempio 1 (esperimento 2)

-         CUT-OFF: 15s

TEST PRESSORIO:

-         una volta c’era la mollettina sulla codaàvaluto t che ci mette per toglierlaàqualitativo

-         RANDALL-SELITTO

-         Sull’arto posterioreàpuntale collegato a un braccio su cui scorre un cursore e + si sposta da sxàdx e + la pressione aumenta

-         Azionata con un pedale

-         Il peso aumenta e sposta l’artoàreazione

-         Espressa in grammi

-         Con analgesicoàinnalza il peso di tanto

-         CUT-OFF: 250g

-         Persone pazienti

-         È utile per discriminare i test analgesici narcotici (livello centrale) dagli antinfiammatori (livello periferico)

-         2 animali

-         induco infiammazione in uno dei 2 arti posteriori

-         l’infiammazione abbassa la soglia dolorifica

-         arto sano risponde a 30g e quello malato a 5g (per entrambi i ratti)

-         tratto 1 ratto con morfina e 1 con aspirina

-         dopo 20’ o 30’àtest:

-         RATTO con ANALGESICOàarto malato sotto puntale: 250g e anche l’arto sano (perché agisce a livello centrale)

-         RATTO con ASPIRINAàarto sano sotto puntale 30g e arto malato da 5à30g

TEST ELETTRICI:

-         scossa elettrica all’animale

-         a seconda degli elettrodi:

-         CONIGLIOàpolpa dentaria degli incisivi e la reazione è lecarsi i denti

-         CAVIAàreagisce con un movimento indietro della testa

-         CANEàreagisce contraendo i muscoli facciali

-         RATTOà2 elettrodi nella coda e reagisce squittendo

-         Misuro la quantità

TEST CHIMICO:

-         sostanze IRRITANTI che iniettate nel peritoneoàparticolare posizione del corpoàstiramentoàWRITHING TEST

-         pochi minuti dopo l’iniezione l’animale ha mal di pancia (il topo) e cammina facendo stiramenti

-         la schiena si inarca e posso contare gli stiramenti

-         analgesicoàmeno o nessuno stiramento

-         le sostanze irritanti sono: acido acetico; parafenilchinone; bradichinina

-         test che si fa complementare ad altro test, sensibile a F analgesici, antinfiammatori e altri F come antistaminici o antimuscarinici (atropina)

-         test NON SPECIFICO per F analgesici

PROCEDIMENTO:

-         3 controlli e 3 trattati per un totale di 6 animali

-         per identificare gli animali uso un colorante e li marco per es:

-         T = testa (segno sulla testa)

-         B = bianco (non ha segni)

-         C = coda (segno sulla coda)

-         I primi 3 animali hanno soluzione fisiologica (controlla)

-         Peso i ratti

-         3 trattati (B, C, T o diversamente) e li peso

-         colonna con 0 = SOGLIA DI BASE prima del trattamento e scrivo i secondi

-         TRATTAMNETO: i primi 3 con fisiologica e i secondi 3 con farmaco

-         Ora esatta del trattamentoàogni volta che tratto l’animale segno il tempo

-         Ottengo un grafico simile a una Gaussiana

-         Uso la media dei 3 controlli con il concetto di errore standard (5 ± 5)

Nel test WRITHING uso parafenilchinone con tutti i topi

-         Un gruppo con ASPIRINA (di solito prima aspirina e poi l’irritante per favorire la competizione)

-         Gruppo controlloàfisiologica + parafenilchinone

-         Fisiologica e aspirina 15’ prima del parafenilchinone (I.P.)

-         Dopo 5’ osservo animali per 30’

-         Valuto sommatoria del numero di stiramenti

STATISTICA:

-         confronto medie dei trattati con medie dei controlli ai vari tempi

-         valuto la differenza tra i 2 gruppià”t” di Student che compara le medie di 2 popolazioni diverse a un determinato tempo

Medie ed Errore Standardà15±2; 3±1 di trattati e controlli

-         confronto con tabelle

-         G.L. (gradi di libertà) n-2 (6-2 = 4)à2.78 se avessi ottenuto tale risultato avrei il 5% ma ho 5.38àvado verso destra nella tabellaà4.60à1% e 0.1%.

ANTIINFIAMMATORI

ANTIINFIAMMATORIO:

-         il test RANDALL-SELITTOàdiscrimina tra analgesici narcotici e antinfiammatori

INFIAMMAZONE: reazione dell’organismo nel tentativo di circoscrivere una lesione che può essere provocata da agenti fisici (caldo, freddo, UV); chimici (sostanze esogene o endogene ma estranee alla composizione del tex); organismi viventi (microrganismi, parassiti o tossine prodotte dai microrganismi).

Dal punto di vista fisicoà

-         rossore (rugor): vasodilatazione locale

-         aumento T locale

-         gonfiore (edema): aumenta permeabilità capillare e fuoriescono liquidi che ristagnano (tumor)

-         dolore: liberazione di particolari mediatori

-         functio laesa: perdita funzione tex infiammato

Le infiammazioni possono essere:

1)      acuteàiniziali; durano poco; i mediatori liberati sono AUTACOIDI (istamina, PG, serotonina, bradikinina)

2)      cronicheàdurano tanto; da acuta per presenza dell’agente infiammante diviene cronica; mediatori di prima + INTERFERON e INTERLEUKINE

Viene messo in attivazione anche il SISTEMA IMMUNITARIO.

FARMACI:

-         FANSà(aspirina, indometacina, ibuprofene, naproxene) agiscono sulle infiammazioni acute; inibiscono le COX (enzimi che trasformano l’acido arachidonico in PG, PC e mediatori dell’infiammazione)

-         STEROIDEIà(glucocorticoidi, cortisone) per le infiammazioni croniche; hanno diverso meccanismo d’azione; agiscono + a monte inibendo le FOSFOLIPASI nel fare acido arachidonico.

TESTS PER INFIAMMAZIONI ACUTE: non esiste un test che possa valutare nello stesso momento tutti i fenomeni

TEST IN VITRO: