UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI BARI

FACOLTA’ DI SCIENZE BIOTECNOLOGICHE

CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE SANITARIE E FARMACEUTICHE

TESI DI LAUREA IN BIOCHIMICA E TECNOLOGIE BIOCHIMICHE

CONTENUTO DI DNA MITOCONDRIALE

NEI MUSCOLI SOLEO ED EDL DI RATTO DURANTE L’INVECCHIAMENTO

E DOPO SOMMINISTRAZIONE DI ALCAR

(ACETIL-L-CARNITINA)

RELATORI:

Chiar.ma Prof.ssa Maria Nicola Gadaleta

Chiar.mo Dr. Vito Pesce

Laureando:

Luigi Nicassio

ANNO ACCADEMICO 2005-2006

RINGRAZIAMENTI

Ringrazio la Professoressa Gadaleta per avermi dato l’opportunità  di elaborare la mia tesi nel suo istituto.

Ringrazio il Dottor Vito Pesce che  ha avuto fiducia nelle mie capacità e mi ha incoraggiato ad andare avanti superando difficoltà nella preparazione della tesi con consigli e suggerimenti.

Un immenso grazie va alla mia famiglia che mi ha sempre incoraggiato e sostenuto in ogni momento, facendomi arrivare dove sono ora.

Inoltre, un ringraziamento ed una dedica speciale va anche ai miei amici ed a tutte le persone che ho conosciuto in questi anni, in particolare Alessandro, Alessio,  Andrea,  Antonietta,  Antonio, Azzurra, Davide, Federica, Giacomo, Giusy, Iole, Ivana, Jonathan, Maurizio, Nicola, Paolo, Pasquale, Raffaele, Roberta, Stefano, Vincenzo e Vito (elencati in rigoroso ordine alfabetico),  che mi sono stati vicini nei momenti più difficili e mi hanno permesso di andare sempre avanti.

1.      INTRODUZIONE

1.1.         STRUTTURA DEI MITOCONDRI

I mitocondri sono organelli citoplasmatici di forma allungata (Figura 1), con diametro di circa 1 mm, presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche in un numero variabile da diverse centinaia fino ad un migliaio circa per cellula.

Sono costituiti da due membrane: la membrana interna e la membrana esterna, lo spazio compreso fra queste due membrane è detto spazio intermembrana.

Inoltre, la membrana interna delimita una regione definita matrice mitocondriale, formando delle sporgenze e rientranze (creste mitocondriali), dove si concentrano gli enzimi che intervengono nel processo di respirazione cellulare.

Le due membrane presentano differenti proprietà dovute alla loro diversa composizione: quella esterna è costituita per circa il 50% da lipidi e il restante 50% da proteine, in particolare enzimi che svolgono molteplici attività[1] e porine, canali proteici transmembrana, fomati per lo più da foglietti β, che rendono la membrana esterna permeabile[2] permettendo il passaggio di molecole di massa fino a 1000 Da.

Invece, la membrana interna è costituita per l’80% da proteine e per il 20% da lipidi; mancano le porine e questo fa si che tale membrana sia molto meno permeabile rispetto a quella esterna, anche se sono comunque presenti una serie di trasportatori transmembrana altamente selettivi per alcune molecole.

La matrice mitocondriale ha una elevata concentrazione di proteine (circa 500 mg/ml) e contiene numerosi enzimi, ribosomi[3] e molecole di DNA circolare a doppio filamento, il DNA mitocondriale (mtDNA).

1.2.          ORIGINE DEI MITOCONDRI

L’ipotesi più suffragata riguardo l’origine dei mitocondri nelle cellule eucariotiche è definita teoria endosimbiontica dell’evoluzione eucariotica.

Questa teoria si basa sull’ipotesi che un batterio aerobio (a-proteobatterio) si sia stabilito, circa due miliardi di anni fa, all’interno del citoplasma di una cellula eucariotica ancestrale creando una interazione mutualistica fornendo energia all’eucariote e ricevendo in cambio un ambiente stabile e riparato ed un rapido apporto di sostanze nutritive (Lang et al., 1999). Col tempo poi, la maggior parte dei geni furono trasferiti dall'endosimbionte ai cromosomi nucleari, fino a giungere alla situazione attuale (Figura 2).

Figura 2   Teoria endosimbiontica degli organelli (da Nelson & Cox, Principi di biochimica di Lehninger, Zanichelli Ed.)

Ci sono molte prove a sostegno della correttezza di questa teoria:

Ø          I mitocondri contengono ribosomi di tipo procariotico;

Ø         La loro funzionalità è inibita dagli stessi antibiotici che interferiscono, in vivo, con i batteri (ad esempio il cloramfenicolo);

Ø         Contengono molecole circolari di DNA, tipiche dei procarioti, prive di introni;

Ø         Si replicano per scissione binaria, indipendentemente dalla cellula.

1.3.          GENOMA MITOCONDRIALE

Il DNA mitocondriale (mtDNA) dei mammiferi è una molecola circolare a doppia elica (Figura 3), superavvolta, costituita da circa 16 kb, contenente 37 geni[4] che codificano per 2 RNA ribosomiali (rRNA)[5], 22 tRNA e 13 subunità del sistema di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) mitocondriale.

Circa 28 dei geni mitocondriali (2 rRNA, 14 tRNA e 12 polipeptidi) sono codificati da uno dei due filamenti del DNA[6] (detto H, da Heavy strand) mentre i rimanenti geni (8 tRNA e 1 polipeptide) sono codificati dal filamento complementare (detto L, da Light strand).

 

Il resto delle proteine presenti nel mitocondrio derivano da geni nucleari i cui prodotti vengono riconosciuti grazie ad una sequenza leader presente a livello del N-terminale e trasportati nei mitocondri.

Proprio per questo motivo, i mitocondri possono essere definiti sistemi a semiautonomia genetica, poiché necessitano dell’espressione anche di geni nucleari per svolgere le loro funzioni. Il genoma nucleare, infatti, codifica le rimanenti subunità dei complessi della catena respiratoria e tutte quelle proteine che intervengono nella replicazione, trascrizione, espressione e nel mantenimento del DNA mitocondriale (Goffart et al., 2003).

Inoltre, il genoma mitocondriale presenta un’altra caratteristica molto importante: nella molecola di DNA si osserva una regione a tripla elica definita “Displacement Loop Region” (D-Loop), dove si osserva un’ansa che si estende per circa 500-600 basi; questa è dovuta alla dislocazione del filamento H dal filamento L ed è mantenuta da un breve tratto di DNA (7S DNA) che viene degradato e risintetizzato di frequente, per mantenere l’apertura del duplex in questo sito, dove è presente l’origine di replicazione.

1.4.          RUOLO DEI MITOCONDRI ALL’INTERNO DELLA CELLULA

Il mitocondrio svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo dei carboidrati, delle proteine e dei lipidi ed in particolare è in grado di estrarre energia dai substrati organici. Infatti, durante le reazioni di ossidazione, gli elettroni che derivano dai substrati ridotti vengono trasferiti attraverso la catena respiratoria della membrana mitocondriale interna all’ossigeno molecolare con formazione di acqua. Questo trasporto porta ad un rilascio di energia che viene immagazzinata in un gradiente protonico ed utilizzata per il distacco di molecole di ATP (fonte di energia fondamentale per le cellule.) dal loro sito di formazione: l’ATP sintasi. Inoltre, il mitocondrio interviene in numerosi altri processi, come ad esempio l’apoptosi, la sintesi dell'eme, la sintesi del colesterolo, la produzione di calore e la regolazione dello stato redox della cellula (Figura 4).

1.5.          L’INVECCHIAMENTO, I MITOCONDRI ED IL TESSUTO MUSCOLARE

Il coinvolgimento dei mitocondri (in modo particolare la loro funzione di centrale energetica della cellula) nell’invecchiamento e nei fenomeni correlati all’età è ormai accertata (Cadenas et al., 2000; Dufour et al., 2004)

Nel mitocondrio viene consumato il 90% dell’O₂ cellulare ed in condizioni fisiologiche l’1% di questo O₂ sfugge alla completa riduzione e viene rilasciato sotto forma di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS). Lo stress ossidativo è la condizione in cui viene a verificarsi uno sbilanciamento tra specie ossidanti e specie antiossidanti in favore delle specie ossidanti, potenzialmente pericolose.

I ROS possono attaccare le proteine, i lipidi e soprattutto il DNA mitocondriale (mtDNA) come propose Harman nel 1956 nella cosiddetta “teoria dei radicali liberi”. L’ mtDNA è particolarmente suscettibile all’attacco dei ROS (e alle Specie Reattive dell’Azoto, RNS) essendo privo di proteine di tipo istonico ed essendo compatto dal punto di vista informazionale, cioè non presenta regioni introniche e quindi è sensibile a qualsiasi attacco da parte dei ROS che colpiranno inevitabilmente regioni codificanti (DiMauro et al., 2002).

Nell’invecchiamento, sono stati riportati un’aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nei mitocondri e/o nella cellula (Gredilla et al., 2001a) ed un deficit dell’ATP disponibile per le attività cellulari (Gredilla et al., 2001b), in alcuni casi legato ad una ridotta efficienza funzionale del sistema di fosforilazione ossidativo (Sanz et al., 2005).

Durante l’invecchiamento, peraltro, la diminuzione della capacità energetica della cellula, dovuta ad una diminuzione con l’età di alcune attività enzimatiche della catena respiratoria mitocondriale, è stata riportata in vari tessuti ed organismi da molti autori (Gadaleta et al., 1999; DiMauro et al., 2004). La diminuzione con l’età della capacità bioenergetica mitocondriale diviene drammatica per quelle cellule post-mitotiche come neuroni e fibre scheletriche muscolari che dipendono in maniera preponderante dal metabolismo ossidativo per le loro necessità energetiche (Barrientos et al., 1996; Lezza et al., 1994).

In letteratura, sono stati riportati molti esempi di disfunzione mitocondriale coinvolta nel processo d’invecchiamento della fibra muscolare scheletrica nell’uomo (Brierley et al., 1998; Müller-Höcker et al., 1990), topo (Kwong et al., 2000) e ratto (Williams et al., 1986).

È stato riportato da molto tempo che la concentrazione del mtDNA è direttamente proporzionale alla capacità ossidativa del muscolo striato di mammiferi (Williams et al., 1986). Recentemente è stato riportato che il numero assoluto di copie di mtDNA nelle singole fibre ossidative di tipo I del muscolo scheletrico umano è doppio di quello delle singole fibre glicolitiche di tipo II (He et al., 2002).

Inoltre, è stato riportato nel muscolo Soleo di ratti di 28 mesi di età, una perdita del mtDNA full-size, un’aumento delle specie delete come anche una diminuzione dell’attività della citocromo c ossidasi (Yarovaya et al., 2002; Pesce et al., 2005) e tali variazioni sono state associate ad un cambiamento delle fibre da lente a veloci e all’atrofia delle fibre stesse. Anche Barazzoni e colleghi riscontrano una diminuzione del contenuto in mtDNA con l’invecchiamento nel muscolo Soleo (Barazzoni et al., 2000; Pesce et al., 2005).

Il danno ossidativo al mtDNA sembra avere un ruolo causale nella sarcopenia età-dipendente. Infatti, molecole di mtDNA mutate, soprattutto delete, colocalizzano nel muscolo di ratto vecchio con la porzione segmentale di fibra che presenta anomalie del sistema di trasporto elettronico, riduzione dell’area trasversale e rottura della fibra stessa (McKenzie et al., 2002).

L’aumento con l’età dei danni ossidativi al mtDNA potrebbe anche inficiare il macchinario replicativo del genoma mitocondriale inducendo variazioni nel contenuto del mtDNA.

I mitocondri sono molto abbondanti all’interno delle cellule del tessuto muscolare. Questo è costituito da un insieme di fibre muscolari, lunghe cellule plurinucleate, derivate dalla fusione di molte cellule embrionarie (Figura 5 e figura 6).

Figure 5 e 6   Fascio di fibre muscolari a diverso ingrandimento osservate al microscopio elettronico a scansione

I muscoli scheletrici si differenziano tra di loro per la loro diversa funzione (determinata geneticamente ed espressa mediante una diversa composizione percentuale di fibre lente e veloci) e quindi anche per il loro contenuto in mitocondri e la loro capacità bioenergetica.

Nel muscolo si possono identificare due principali tipi di fibre:

Ø          Tipo I : ricche di mitocondri e citocromi con un metabolismo di tipo ossidativo.

Ø          Tipo II : povere di mitocondri con un metabolismo basato sulla glicolisi.

Ci sono muscoli costituiti prevalentemente da fibre di tipo I  come, ad esempio, il Soleo e muscoli costituiti soprattutto da fibre di tipo II come l’Extensor digitorum longus (EDL) (Figura 7).

Figura 7    Muscoli della gamba nell’uomo

Con l’invecchiamento, il muscolo scheletrico va incontro a perdita di massa e forza muscolare (Morley et al., 2000).

Nell'uomo la massa muscolare si riduce del 40% tra i 20 e gli 80 anni d'età (Evans, 1995) e ciò causa problemi nella motilità e nell'immagazzinamento di energia.

Questa riduzione viene attribuita sia all'atrofia delle fibre (Lexell et al., 1988; Brown et al., 1992), sia alla perdita significativa delle fibre stesse cioè alla sarcopenia (Larsson e Edstrom 1986; Ishihara et al., 1987).

Molti studi hanno mostrato che esiste una correlazione tra l’invecchiamento (e quindi l’atrofia muscolare che ne deriva) ed i mitocondri. Più precisamente, è stata individuata una delezione nel DNA mitocondriale (delezione comune), la cui incidenza aumenta in funzione dell’età sia nel muscolo scheletrico umano (Pesce et al., 2001) che in quello di ratto (Pesce et al. 2005) che in altri organi.

Altri studi, inoltre, correlano le alterazioni del DNA con una riduzione della quantità di mtDNA in alcuni tessuti.

Tuttavia, questa variazione del numero di copie di mtDNA non è ancora ben definita nei dettagli. Ad esempio, nell’uomo intorno ai cinquanta anni d’età, si osserva un raddoppio del numero di copie del genoma mitocondriale probabilmente dovuto ad un meccanismo che tenta di opporsi alla riduzione dell’attività di respirazione cellulare evidenziata dalla presenza ed aumento di fibre Ragged Red Fiber (RRF o SDH⁺⁺) e da fibre citocromo ossidasi deficienti (COX^-) (Pesce et al., 2001).

Mentre in alcuni organi (fegato, reni) di ratto è stato osservato un aumento del contenuto di mtDNA con l’invecchiamento (Dinardo et al., 2003), in alcuni muscoli quali Soleo ed Gastrocnemio è stato riportato una diminuzione dello stesso mentre in altri come l’EDL tale contenuto in mtDNA non varia con l’età (Barazzoni et al., 2000; Pesce et al., 2005).

Di sicuro, per quanto riguarda il muscolo scheletrico, grande importanza riveste il tipo di fibre presenti, poiché una diminuzione di fibre di tipo I si accompagna ad una diminuzione di mitocondri e quindi di mtDNA.

1.6.   BIOGENESI MITOCONDRIALE

Il metabolismo aerobico dipende dalla capacità dei mitocondri di generare ATP a velocità sufficiente da soddisfare la domanda energetica dei tessuti. I mitocondri possono cambiare in numero, in forma e in dimensioni in seguito a vari stimoli fisiologici attraverso processi complicati e non ancora ampiamente conosciuti. Nel momento in cui ci sono variazioni nella richiesta energetica, la cellula può regolare il proprio metabolismo attivando la biogenesi mitocondriale.

La biogenesi mitocondriale nel muscolo scheletrico può essere stimolata:

•         Dall’esercizio fisico “endurance training” (Holloszy et al., 1967), (Figura 8).

•         Dalla stimolazione elettrica cronica (Williams et al. 1987).

•         Dalla stimolazione ormonale (ormoni tiroidei, Tata et al. 1963; Gadaleta et al. 1972).

La biogenesi mitocondriale è legata all’attività di due classi di regolatori trascrizionali:

Ø          Fattori di trascrizione nucleari che regolano la trascrizione dei geni mitocondriali codificati dal DNA nucleare; tra di essi vi è NRF-1 (Figura 9), fattore di trascrizione di una serie di geni mitocondriali che codificano per, ad esempio: citocromo c, subunità b e g  dell’ATP sintasi, il fattore di trascrizione TFAM, ecc..

NRF-1 è un polipeptide di 68 KDa che si lega e regola la trascrizione di molti geni coinvolti nella funzione e nella biogenesi mitocondriale. Tali geni sono stati identificati mediante la caratterizzazione di un sito di legame funzionale a NRF-1 nei loro promotori. Anche TFAM è un gene target di NRF-1 e ciò è in accordo con il fatto che NRF-1 ha un ruolo di integrazione nell’interazione nucleo-mitocondrio (Kelly et al., 2004). Topi con il gene per NRF-1 distrutto, presentano blastocisti difettive nel mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale e mostrano una riduzione severa del livello di mtDNA (Huo et al., 2001). La overespressione di NRF-1 nel muscolo scheletrico di topi transgenici attiva la proliferazione mitocondriale e la formazione di fibre muscolari ossidative di tipo I ricche in mitocondri (Lin et al., 2002).