Tesi Biotecnologie

Ringrazio la Professoressa Gadaleta per avermi dato l’opportunità di elaborare la mia tesi nel suo istituto.

Ringrazio il Dottor Vito Pesce che ha avuto fiducia nelle mie capacità e mi ha incoraggiato ad andare avanti superando difficoltà nella preparazione della tesi con consigli e suggerimenti.

Un immenso grazie va alla mia famiglia che mi ha sempre incoraggiato e sostenuto in ogni momento, facendomi arrivare dove sono ora.

Inoltre, un ringraziamento ed una dedica speciale va anche ai miei amici ed a tutte le persone che ho conosciuto in questi anni, in particolare Alessandro, Alessio, Andrea, Antonietta, Antonio, Azzurra, Davide, Federica, Giacomo, Giusy, Iole, Ivana, Jonathan, Maurizio, Nicola, Paolo, Pasquale, Raffaele, Roberta, Stefano, Vincenzo e Vito (elencati in rigoroso ordine alfabetico), che mi sono stati vicini nei momenti più difficili e mi hanno permesso di andare sempre avanti.

I mitocondri sono organelli citoplasmatici di forma allungata (Figura 1), con diametro di circa 1 mm, presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche in un numero variabile da diverse centinaia fino ad un migliaio circa per cellula.

Sono costituiti da due membrane: la membrana interna e la membrana esterna, lo spazio compreso fra queste due membrane è detto spazio intermembrana.

Inoltre, la membrana interna delimita una regione definita matrice mitocondriale, formando delle sporgenze e rientranze (creste mitocondriali), dove si concentrano gli enzimi che intervengono nel processo di respirazione cellulare.

Le due membrane presentano differenti proprietà dovute alla loro diversa composizione: quella esterna è costituita per circa il 50% da lipidi e il restante 50% da proteine, in particolare enzimi che svolgono molteplici attività[1] e porine, canali proteici transmembrana, fomati per lo più da foglietti β, che rendono la membrana esterna permeabile[2] permettendo il passaggio di molecole di massa fino a 1000 Da.

Invece, la membrana interna è costituita per l’80% da proteine e per il 20% da lipidi; mancano le porine e questo fa si che tale membrana sia molto meno permeabile rispetto a quella esterna, anche se sono comunque presenti una serie di trasportatori transmembrana altamente selettivi per alcune molecole.

La matrice mitocondriale ha una elevata concentrazione di proteine (circa 500 mg/ml) e contiene numerosi enzimi, ribosomi[3] e molecole di DNA circolare a doppio filamento, il DNA mitocondriale (mtDNA).

L’ipotesi più suffragata riguardo l’origine dei mitocondri nelle cellule eucariotiche è definita teoria endosimbiontica dell’evoluzione eucariotica.

Questa teoria si basa sull’ipotesi che un batterio aerobio (a-proteobatterio) si sia stabilito, circa due miliardi di anni fa, all’interno del citoplasma di una cellula eucariotica ancestrale creando una interazione mutualistica fornendo energia all’eucariote e ricevendo in cambio un ambiente stabile e riparato ed un rapido apporto di sostanze nutritive (Lang et al., 1999). Col tempo poi, la maggior parte dei geni furono trasferiti dall'endosimbionte ai cromosomi nucleari, fino a giungere alla situazione attuale (Figura 2).

Figura 2 Teoria endosimbiontica degli organelli (da Nelson & Cox, Principi di biochimica di Lehninger, Zanichelli Ed.)

Ø La loro funzionalità è inibita dagli stessi antibiotici che interferiscono, in vivo, con i batteri (ad esempio il cloramfenicolo);

Ø Contengono molecole circolari di DNA, tipiche dei procarioti, prive di introni;

Il DNA mitocondriale (mtDNA) dei mammiferi è una molecola circolare a doppia elica (Figura 3), superavvolta, costituita da circa 16 kb, contenente 37 geni[4] che codificano per 2 RNA ribosomiali (rRNA)[5], 22 tRNA e 13 subunità del sistema di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) mitocondriale.

Circa 28 dei geni mitocondriali (2 rRNA, 14 tRNA e 12 polipeptidi) sono codificati da uno dei due filamenti del DNA[6] (detto H, da Heavy strand) mentre i rimanenti geni (8 tRNA e 1 polipeptide) sono codificati dal filamento complementare (detto L, da Light strand).

Il resto delle proteine presenti nel mitocondrio derivano da geni nucleari i cui prodotti vengono riconosciuti grazie ad una sequenza leader presente a livello del N-terminale e trasportati nei mitocondri.

Proprio per questo motivo, i mitocondri possono essere definiti sistemi a semiautonomia genetica, poiché necessitano dell’espressione anche di geni nucleari per svolgere le loro funzioni. Il genoma nucleare, infatti, codifica le rimanenti subunità dei complessi della catena respiratoria e tutte quelle proteine che intervengono nella replicazione, trascrizione, espressione e nel mantenimento del DNA mitocondriale (Goffart et al., 2003).

Inoltre, il genoma mitocondriale presenta un’altra caratteristica molto importante: nella molecola di DNA si osserva una regione a tripla elica definita “Displacement Loop Region” (D-Loop), dove si osserva un’ansa che si estende per circa 500-600 basi; questa è dovuta alla dislocazione del filamento H dal filamento L ed è mantenuta da un breve tratto di DNA (7S DNA) che viene degradato e risintetizzato di frequente, per mantenere l’apertura del duplex in questo sito, dove è presente l’origine di replicazione.

Il mitocondrio svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo dei carboidrati, delle proteine e dei lipidi ed in particolare è in grado di estrarre energia dai substrati organici. Infatti, durante le reazioni di ossidazione, gli elettroni che derivano dai substrati ridotti vengono trasferiti attraverso la catena respiratoria della membrana mitocondriale interna all’ossigeno molecolare con formazione di acqua. Questo trasporto porta ad un rilascio di energia che viene immagazzinata in un gradiente protonico ed utilizzata per il distacco di molecole di ATP (fonte di energia fondamentale per le cellule.) dal loro sito di formazione: l’ATP sintasi. Inoltre, il mitocondrio interviene in numerosi altri processi, come ad esempio l’apoptosi, la sintesi dell'eme, la sintesi del colesterolo, la produzione di calore e la regolazione dello stato redox della cellula (Figura 4).

Il coinvolgimento dei mitocondri (in modo particolare la loro funzione di centrale energetica della cellula) nell’invecchiamento e nei fenomeni correlati all’età è ormai accertata (Cadenas et al., 2000; Dufour et al., 2004)

Nel mitocondrio viene consumato il 90% dell’O₂ cellulare ed in condizioni fisiologiche l’1% di questo O₂ sfugge alla completa riduzione e viene rilasciato sotto forma di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS). Lo stress ossidativo è la condizione in cui viene a verificarsi uno sbilanciamento tra specie ossidanti e specie antiossidanti in favore delle specie ossidanti, potenzialmente pericolose.

I ROS possono attaccare le proteine, i lipidi e soprattutto il DNA mitocondriale (mtDNA) come propose Harman nel 1956 nella cosiddetta “teoria dei radicali liberi”. L’ mtDNA è particolarmente suscettibile all’attacco dei ROS (e alle Specie Reattive dell’Azoto, RNS) essendo privo di proteine di tipo istonico ed essendo compatto dal punto di vista informazionale, cioè non presenta regioni introniche e quindi è sensibile a qualsiasi attacco da parte dei ROS che colpiranno inevitabilmente regioni codificanti (DiMauro et al., 2002).

Nell’invecchiamento, sono stati riportati un’aumentata produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nei mitocondri e/o nella cellula (Gredilla et al., 2001a) ed un deficit dell’ATP disponibile per le attività cellulari (Gredilla et al., 2001b), in alcuni casi legato ad una ridotta efficienza funzionale del sistema di fosforilazione ossidativo (Sanz et al., 2005).

Durante l’invecchiamento, peraltro, la diminuzione della capacità energetica della cellula, dovuta ad una diminuzione con l’età di alcune attività enzimatiche della catena respiratoria mitocondriale, è stata riportata in vari tessuti ed organismi da molti autori (Gadaleta et al., 1999; DiMauro et al., 2004). La diminuzione con l’età della capacità bioenergetica mitocondriale diviene drammatica per quelle cellule post-mitotiche come neuroni e fibre scheletriche muscolari che dipendono in maniera preponderante dal metabolismo ossidativo per le loro necessità energetiche (Barrientos et al., 1996; Lezza et al., 1994).

In letteratura, sono stati riportati molti esempi di disfunzione mitocondriale coinvolta nel processo d’invecchiamento della fibra muscolare scheletrica nell’uomo (Brierley et al., 1998; Müller-Höcker et al., 1990), topo (Kwong et al., 2000) e ratto (Williams et al., 1986).

È stato riportato da molto tempo che la concentrazione del mtDNA è direttamente proporzionale alla capacità ossidativa del muscolo striato di mammiferi (Williams et al., 1986). Recentemente è stato riportato che il numero assoluto di copie di mtDNA nelle singole fibre ossidative di tipo I del muscolo scheletrico umano è doppio di quello delle singole fibre glicolitiche di tipo II (He et al., 2002).

Inoltre, è stato riportato nel muscolo Soleo di ratti di 28 mesi di età, una perdita del mtDNA full-size, un’aumento delle specie delete come anche una diminuzione dell’attività della citocromo c ossidasi (Yarovaya et al., 2002; Pesce et al., 2005) e tali variazioni sono state associate ad un cambiamento delle fibre da lente a veloci e all’atrofia delle fibre stesse. Anche Barazzoni e colleghi riscontrano una diminuzione del contenuto in mtDNA con l’invecchiamento nel muscolo Soleo (Barazzoni et al., 2000; Pesce et al., 2005).

Il danno ossidativo al mtDNA sembra avere un ruolo causale nella sarcopenia età-dipendente. Infatti, molecole di mtDNA mutate, soprattutto delete, colocalizzano nel muscolo di ratto vecchio con la porzione segmentale di fibra che presenta anomalie del sistema di trasporto elettronico, riduzione dell’area trasversale e rottura della fibra stessa (McKenzie et al., 2002).

L’aumento con l’età dei danni ossidativi al mtDNA potrebbe anche inficiare il macchinario replicativo del genoma mitocondriale inducendo variazioni nel contenuto del mtDNA.

I mitocondri sono molto abbondanti all’interno delle cellule del tessuto muscolare. Questo è costituito da un insieme di fibre muscolari, lunghe cellule plurinucleate, derivate dalla fusione di molte cellule embrionarie (Figura 5 e figura 6).

Figure 5 e 6 Fascio di fibre muscolari a diverso ingrandimento osservate al microscopio elettronico a scansione

I muscoli scheletrici si differenziano tra di loro per la loro diversa funzione (determinata geneticamente ed espressa mediante una diversa composizione percentuale di fibre lente e veloci) e quindi anche per il loro contenuto in mitocondri e la loro capacità bioenergetica.

Ø Tipo I : ricche di mitocondri e citocromi con un metabolismo di tipo ossidativo.

Ci sono muscoli costituiti prevalentemente da fibre di tipo I come, ad esempio, il Soleo e muscoli costituiti soprattutto da fibre di tipo II come l’Extensor digitorum longus (EDL) (Figura 7).

Con l’invecchiamento, il muscolo scheletrico va incontro a perdita di massa e forza muscolare (Morley et al., 2000).

Nell'uomo la massa muscolare si riduce del 40% tra i 20 e gli 80 anni d'età (Evans, 1995) e ciò causa problemi nella motilità e nell'immagazzinamento di energia.

Questa riduzione viene attribuita sia all'atrofia delle fibre (Lexell et al., 1988; Brown et al., 1992), sia alla perdita significativa delle fibre stesse cioè alla sarcopenia (Larsson e Edstrom 1986; Ishihara et al., 1987).

Molti studi hanno mostrato che esiste una correlazione tra l’invecchiamento (e quindi l’atrofia muscolare che ne deriva) ed i mitocondri. Più precisamente, è stata individuata una delezione nel DNA mitocondriale (delezione comune), la cui incidenza aumenta in funzione dell’età sia nel muscolo scheletrico umano (Pesce et al., 2001) che in quello di ratto (Pesce et al. 2005) che in altri organi.

Altri studi, inoltre, correlano le alterazioni del DNA con una riduzione della quantità di mtDNA in alcuni tessuti.

Tuttavia, questa variazione del numero di copie di mtDNA non è ancora ben definita nei dettagli. Ad esempio, nell’uomo intorno ai cinquanta anni d’età, si osserva un raddoppio del numero di copie del genoma mitocondriale probabilmente dovuto ad un meccanismo che tenta di opporsi alla riduzione dell’attività di respirazione cellulare evidenziata dalla presenza ed aumento di fibre Ragged Red Fiber (RRF o SDH⁺⁺) e da fibre citocromo ossidasi deficienti (COX^-) (Pesce et al., 2001).

Mentre in alcuni organi (fegato, reni) di ratto è stato osservato un aumento del contenuto di mtDNA con l’invecchiamento (Dinardo et al., 2003), in alcuni muscoli quali Soleo ed Gastrocnemio è stato riportato una diminuzione dello stesso mentre in altri come l’EDL tale contenuto in mtDNA non varia con l’età (Barazzoni et al., 2000; Pesce et al., 2005).

Di sicuro, per quanto riguarda il muscolo scheletrico, grande importanza riveste il tipo di fibre presenti, poiché una diminuzione di fibre di tipo I si accompagna ad una diminuzione di mitocondri e quindi di mtDNA.

Il metabolismo aerobico dipende dalla capacità dei mitocondri di generare ATP a velocità sufficiente da soddisfare la domanda energetica dei tessuti. I mitocondri possono cambiare in numero, in forma e in dimensioni in seguito a vari stimoli fisiologici attraverso processi complicati e non ancora ampiamente conosciuti. Nel momento in cui ci sono variazioni nella richiesta energetica, la cellula può regolare il proprio metabolismo attivando la biogenesi mitocondriale.

• Dall’esercizio fisico “endurance training” (Holloszy et al., 1967), (Figura 8).

• Dalla stimolazione ormonale (ormoni tiroidei, Tata et al. 1963; Gadaleta et al. 1972).

La biogenesi mitocondriale è legata all’attività di due classi di regolatori trascrizionali:

Ø Fattori di trascrizione nucleari che regolano la trascrizione dei geni mitocondriali codificati dal DNA nucleare; tra di essi vi è NRF-1 (Figura 9), fattore di trascrizione di una serie di geni mitocondriali che codificano per, ad esempio: citocromo c, subunità b e g dell’ATP sintasi, il fattore di trascrizione TFAM, ecc..

NRF-1 è un polipeptide di 68 KDa che si lega e regola la trascrizione di molti geni coinvolti nella funzione e nella biogenesi mitocondriale. Tali geni sono stati identificati mediante la caratterizzazione di un sito di legame funzionale a NRF-1 nei loro promotori. Anche TFAM è un gene target di NRF-1 e ciò è in accordo con il fatto che NRF-1 ha un ruolo di integrazione nell’interazione nucleo-mitocondrio (Kelly et al., 2004). Topi con il gene per NRF-1 distrutto, presentano blastocisti difettive nel mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale e mostrano una riduzione severa del livello di mtDNA (Huo et al., 2001). La overespressione di NRF-1 nel muscolo scheletrico di topi transgenici attiva la proliferazione mitocondriale e la formazione di fibre muscolari ossidative di tipo I ricche in mitocondri (Lin et al., 2002).

NRF-1 è, a sua volta, sotto il controllo di un coattivatore trascrizionale, PGC-1 (PPARγ coactivator-1), (Puigserver et al., 1998). PGC1-a si lega a proteine con attività di istone acetilasi (HAT) come CBP, p300 e SRC1, in grado di acetilare gli istoni e modificare la cromatina, permettendo l’accesso ai fattori che attivano la trascrizione e promuovendo così anche la biogenesi mitocondriale (Figura 10).

Fattori di trascrizione nucleari che regolano la trascrizione e replicazione del DNA mitocondriale, ad esempio: TFAM e TFBs, che si legano a livello del D-loop del DNA mitocondriale (Figura 11). Molte evidenze indicano che un ruolo rilevante nel mantenimento e nella replicazione del mtDNA è assegnato al fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM). Topi knock-out per TFAM mostrano una letalità embrionale insieme ad una deplezione del mtDNA (Larsson et al., 1998). I livelli di TFAM correlano bene sia con l’aumento di mtDNA nelle fibre muscolari ragged red (Larsson et al., 1994) che con la diminuzione del livello di mtDNA in cellule deplete di mtDNA (Poulton et al., 1994). L’espressione di TFAM, inoltre, sembra essere affetta da diversi tipi di stimoli che influenzano la proliferazione mitocondriale (Shadel et al., 1997; Hood et al., 2001). Infine, un aumento con l’età del contenuto di mtDNA (Pesce et al., 2001 ) e di quello di TFAM (Lezza et al., 2001) è stato riportato in campioni di muscolo scheletrico umano ed in vari tessuti di ratto (Dinardo et al., 2003).

La carnitina (L3-idrossi-4-N,N,N-trimetilamminobutirrato) è un metabolita essenziale per la cellula, poiché svolge numerosi compiti (Figura 12):

Ø Permette l’ingresso degli acidi grassi attivati a catena lunga nella matrice mitocondriale attraverso il trasportatore “acil-carnitina / carnitina” (McGarry and Brown 1997; Ramsay et al., 2001).

Ø Trasferisce i prodotti della b-ossidazione perossisomiale, incluso l'acetil-CoA, ai mitocondri per l'ossidazione a CO₂ e H₂O nel ciclo di Krebs (Wanders et al., 1995; Verhoeven et al., 1998).

Ø Controlla il rapporto acetil-CoA/CoA (McGarry e Brown 1997; Carter et al., 1995).

Ø Conserva energia sotto forma di acetilcarnitina (Bremer 1983; Carter et al., 1995).

Negli animali, la maggior parte di carnitina viene ottenuta dalla dieta (carne, pesce e latticini); un restante 25%, invece, viene sintetizzato de novo dagli amminoacidi lisina e metionina (Vaz and Wanders 2002).

Dalla carnitina deriva un estere, l’acetil-L-carnitina (ALCAR) presente in molti tessuti animali (Bieber et al., 1982) ed usata in ambito clinico come micronutriente nei casi di deficienza di metabolismo energetico. Infatti, l’ALCAR funge da substrato in grado di attivare una serie di processi mitocondriali, ad esempio favorendo una rapida ossidazione degli acidi grassi endogeni.

Inoltre, in alcune linee cellulari, l'ALCAR può intervenire nella regolazione dell’espressione di alcuni geni implicati nella biogenesi mitocondriale, probabilmente agendo a livello dell’acetilazione ed attivazione dell’istone H₄ (Pisano et al., 1996)

L’acetil-L-carnitina somministrata per un mese, a ratti di 28 mesi (1.5% di ALCAR nell’acqua da bere) determina un aumento del 30% del contenuto di TFAM nel Soleo mentre rimane invariato nell'EDL; dopo due mesi di trattamento nel Soleo i livelli di TFAM rimanevano ancora alti, mentre nell'EDL raddoppiavano. Infine, dopo due mesi di trattamento e un mese senza somministrazione di acetil-L-carnitina (restore) i livelli di TFAM tornavano ai valori controllo solo nel Soleo mentre nell'EDL rimanevano alti (Pesce et al., 2004).

Le differenze osservate a livello dei due tipi di muscoli possono essere dovute alla diversa composizione in fibre e, di conseguenza, al diverso contenuto di DNA e RNA mitocondriale.

Si è così ipotizzato che l’ALCAR possa agire a livello dell’espressione di TFAM, che, a sua volta, è implicato nella regolazione della trascrizione e della replicazione del mtDNA nel muscolo scheletrico. (Pesce et al., 2004).

L’ALCAR, d’altra parte, potrebbe determinare un aumento del flusso di elettroni attraverso la catena respiratoria con conseguente aumento della produzione di ROS, i quali vengono eliminati più difficilmente con l’invecchiamento.

E’ stato dimostrato che, nel fegato, tale aumento di ROS può essere regolato dalla contemporanea somministrazione di un antiossidante come l’acido lipoico, insieme all’ALCAR (Hagen et al., 1998, 1999).

L’acetil-L-carnitina, nei ratti giovani, determina, inoltre, un minore accumulo di grasso corporeo a seguito della stimolazione della sua ossidazione, mentre, nei ratti vecchi aumenta l’efficienza della fosforilazione ossidativa portando ad una produzione maggiore di ATP, che può essere utilizzato nella sintesi proteica con conseguente aumento del deposito di proteine (Iossa et al., 2002).

Infine, la somministrazione di ALCAR in ratti determina una riduzione dei livelli plasmatici di trigliceridi e colesterolo (Ruggiero et al., 1990)

E’ stato recentemente riportato nel ratto una diminuzione del livello di mtDNA, con l’età, muscolo specifica, in quanto presente nel muscolo Soleo ma assente nell’EDL (Pesce et al., 2005).

I muscoli scheletrici, infatti, si differenziano tra di loro per la loro diversa funzione (determinata geneticamente ed espressa mediante una diversa composizione percentuale di fibre lente e veloci) e quindi anche per il loro contenuto in mitocondri e la loro capacità bioenergetica.

E’ stato inoltre riportato (Pesce et al, 2005) un aumento con l’età della proteina TFAM (fattore di trascrizione mitocondriale che ha un ruolo rilevante nel mantenimento e nella replicazione del mtDNA), nel Soleo ma non nell’EDL.

D’altra parte è stato riportato dallo stesso gruppo (Pesce et al, 2004) che l’acetil-L-carnitina (ALCAR) è in grado di far aumentare durante l’invecchiamento sia nel SOLEO, dopo 1 mese di trattamento, che nell’EDL, dopo 2 mesi di trattamento, il livello di proteina TFAM e che tale livello nell’EDL rimane alto anche nel mese successivo al trattamento stesso.

Scopo di questa tesi è stato pertanto di verificare se la somministrazione di ALCAR, micronutriente usato nei casi di deficienza del metabolismo energetico, fosse capace di prevenire lo stato atrofico dei muscoli scheletrici in ratti invecchiati favorendo e/o attivando la biogenesi mitocondriale e quindi in definitiva aumentando il contenuto in mtDNA.

Sono stati studiati, in ratti di 6 e 28 mesi di età con o senza somministrazione di ALCAR nell’acqua da bere alla concentrazione del 1,5% (Hagen et al., 1998), due muscoli della zampa posteriore: il muscolo Soleo (rappresentativo dei muscoli lenti con un elevata percentuale di fibre muscolari a contrazione lenta e con metabolismo prevalentemente ossidativo) ed il muscolo Estensore Lungo delle Dita (EDL) (rappresentativo dei muscoli veloci con un elevata percentuale di fibre muscolari a contrazione veloce e metabolismo prevalentemente glicolitico)

Il contenuto del mtDNA nei muscoli Soleo ed EDL, è stato quantificato mediante una applicazione specifica della Real Time PCR. Sono stati usati primers specifici e sonde TaqMan (Applied Biosystem) per la regione mitocondriale del D-Loop e per il gene nucleare della b-actina opportunamente disegnate usando il software Primer Express (Applied Biosystem).

[1] Ad esempio: l'ossidazione dell’adrenalina, l'allungamento degli acidi grassi e la degradazione del triptofano.

[2] Questa elevata permeabilità era già nota all'inizio del XX secolo, quando venne notato il rigonfiamento a cui i mitocondri sono soggetti a seguito della loro immersione in una soluzione ipotonica.

[3] Dotati di dimensioni minori rispetto a quelli presenti nel resto della cellula

[4] Il numero di geni e le dimensioni del genoma riportate sono riferiti ai mammiferi e soggetti a variabilità a seconda delle specie

[5] 12S e16S

[6] La distinzione delle due eliche avviene in base alla diversa densità di galleggiamento per centrifugazione su gradiente di cloruro di cesio (Anderson et al., 1981)

L’analisi quantitativa del DNA mitocondriale è stata effettuata sui muscoli Soleo ed EDL dell’arto posteriore destro di ratti maschi Fischer 344 (Charles-River). In particolare, sono stati analizzati cinque gruppi di ratti:

Ø 5° Gruppo: animali di 28 mesi trattati per 2mesi con ALCAR ed analizzati 1 mese dopo la fine di tale trattamento

Dopo il sacrificio i muscoli sono stati asportati e congelati in azoto liquido fino al momento dell’utilizzo.

L’ALCAR è stata somministrata oralmente sciolta nell’acqua da bere alla concentrazione dell’1,5% dopo aver portato la soluzione a pH 6.0.

Per l’estrazione di DNA totale (nucleare e mitocondriale), è stato utilizzato il kit di estrazione Wizard Genomic DNA Purification (Promega).

Campioni di 30-50 mg di muscoli scheletrici Soleo ed EDL sono stati polverizzati in un mortaio in azoto liquido, quindi trasferiti in eppendorf in cui sono stati aggiunti 600 μl di Nuclei Lysis Solution.

Mediante un micropestello sterile, sono stati accuratamente omogeneizzati ed incubati per 30 minuti a 65^oC.

L’RNA presente nell’estratto è stato degradato incubando il campione a 37^oC per 30’ con una soluzione 5 ng/μl di Rnasi A.

Dopodichè, sono stati aggiunti 200 μl di Protein Precipitation Solution per favorire la precipitazione delle proteine e centrifugati a 16.000 g per 4’.

Il sovranatante ottenuto è stato precipitato con un ugual volume di isopropanolo e dopo una successiva centrifugazione a 16.000 g per 1’, il pellet ottenuto è stato lavato con 1ml di etanolo al 70%.

E’ stata effettuata un’ulteriore centrifugazione alla stessa velocità e tempo ed il pellet è stato risospeso in 50 μl di H₂O sterile.

Dopo l’estrazione, il DNA genomico totale è stato dosato spettrofotometricamente leggendone l’assorbanza a 260 nm.

Il DNA estratto è stato sottoposto a corsa elettroforetica su un gel d’agarosio allo 0.8% in TAE 1X.

Infine i campioni di DNA sono stai congelati a –20^oC sino al loro utilizzo. La concentrazione del DNA totale isolato è risultata mediamente intorno a 1-2 μg/mg tessuto.

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che permette l’amplificazione di selettiva di una sequenza genomica ed è caratterizzata da elevata sensibilità, specificità e risoluzione.

Le componenti necessarie per effettuare la reazione sono: templato (cioè il DNA estratto, che verrà utilizzato come stampo per l’amplificazione.); primers (sono oligonucleotidi generalmente di dimensioni 18-30 nucleotidi, che, appaiandosi a regioni esterne della sequenza da amplificare, a monte e a valle, fungono da innesco dell’amplificazione.); dNTPs (si necessita dei quattro tipi di desossinucleotidi in quantità bilanciata.); DNA polimerasi (è l’enzima deputato alla reazione di polimerizzazione, generalmente di utilizza la Taq polimerasi, essendo termostabile.); Mg²⁺ (necessario per l’attività della polimerasi.); Buffer (di solito è Tris-HCl; stabilizza il pH.).

La reazione di polimerizzazione viene effettuata in un termociclatore (Figura 13), strumento in grado di variare la temperatura molto rapidamente.

Qui, infatti, avvengono una serie di cicli (30-40), ognuno che consiste di tre steps (Figura 14):

2) Annealing à I primers si appaiano a monte e a valle del segmento da amplificare; la temperatura di questa fase dipende dai primers (Melting Temperature).

La curva reale si ottiene in seguito al raggiungimento del punto di saturazione, dovuto al fatto che:

La PCR Real Time è un metodo di amplificazione e quantificazione in tempo reale del DNA; infatti permette di monitorare l’amplificazione del DNA target in tempo reale, mediante l’utilizzo di fluorocromi. Essendo la metodica di tipo quantitativo, può essere utilizzata per quantificare l’espressione di un gene.

Ø La quantificazione è svolta nella fase esponenziale della cinetica di amplificazione (Figura 16), durante la quale il prodotto amplificato è linearmente proporzionale alla quantità iniziale di stampo e non alla fine nella fase di plateau, come la normale PCR (metodica end-point)

Ø Esiste un sistema di monitoraggio, che permette di osservare ad ogni ciclo, l’andamento della PCR.

Ø E’ una tecnica molto più sensibile di circa 1-2 log rispetto alla classica.

Non ci sono operazioni post-PCR, quindi non è necessario aprire la piastra, con meno rischi di contaminazioni.

Come in una normale PCR, si utilizza un termociclatore, per il passaggio da una temperatura all’altra durante i vari steps della reazione.

Nel coperchio, c’è un modulo ottico con una sorgente laser che eccita i fluorocromi; poi un detector raccoglie i dati di fluorescenza emessi da ciascun campione (Figura 17) e li trasmette ad un computer; qui un software permette di visualizzare la cinetica di formazione dell’amplificato, mediante l’incremento di fluorescenza. Viene costruito un grafico nel quale sull’asse delle ascisse ci sono i cicli di reazione e su quello delle ordinate l’incremento della fluorescenza.

Il sistema è in grado di rilevare anche più segnali di fluorescenza e per questo, è possibile usare più fluorocromi[8] amplificando diversi target nella stessa reazione.

Inoltre, al tempo zero, il sistema non è silente, ma c’è, comunque, una fluorescenza di background, cioè aspecifica, propria dei fluorocromi.

Per questo motivo, nella costruzione della curva della cinetica di reazione, è presente una “baseline”, che separa la fluorescenza specifica da quella aspecifica. Tutto ciò che si registra sotto tale linea è il background.

Inoltre, è opportuno anche definire il “threshold” (o valore soglia), cioè quel valore di fluorescenza pari a dieci volte la deviazione standard della fluorescenza registrata nei primi cicli di amplificazione (e quindi il background). Quel ciclo al quale la curva del nostro campione interseca la retta di threshold, prende il nome di “ciclo threshold” (Ct), che rappresenta il numero di cicli dal quale si ha la produzione di fluorescenza specifica ed è un indicatore, quindi, del numero di copie iniziali (Figura 18).

Esiste una proporzionalità tra i valori di Ct di campioni che differiscono nel numero di copie:

- Campioni che contengono una quantità di DNA iniziale una il doppio dell’altra, hanno valori di Ct che differiscono di uno.

- Campioni che possiedono quantità di DNA iniziale che differiscono di 1 log, hanno una differenza di Ct di 3,3.

La quantificazione di un campione sconosciuto può essere effettuata mediante due modalità:

Ø Assoluta à Viene usata, ad esempio, per valutare il numero di copie virali contenute in un dato campione biologico ed ogni qual volta si può costruire una retta di regressione standard, utilizzando diverse diluizioni di un campione noto. Sull’asse delle ordinate riportiamo i valori di Ct e sull’asse delle ascisse le concentrazioni note (Figura 19). Dopo la costruzione di questa retta di taratura, interpolando il valore di Ct del nostro campione incognito,

Ø Relativa à E’ adottata per analizzare e confrontare una data popolazione o campione rispetto ad un’altra di controllo.

In questa quantificazione, è importante normalizzare i dati, cioè rapportare il segnale relativo al nostro campione con quello di un gene costitutivo di riferimento, la cui espressione sia invariata tra le due popolazioni analizzate.

- Comparative Ct method: Prima di tutto, bisogna dimostrare, mediante un test di validazione, che le efficienze di amplificazione del nostro campione e del gene costitutivo siano paragonabili. Per questo motivo, si effettuano una serie di diluizioni (5-6) sia per il target, sia per il controllo sui quali si procede con l’amplificazione. Si ottengono i valori di Ct e le curve di amplificazione e si costruisce una retta di interpolazione, riportando i valori di DCt (Ct_target– Ct_controllo) in funzione del logaritmo della concentrazione relativa.

Se il coefficiente angolare di tale retta (definito indice della parogonabilità dell’efficienza di amplificazione dei due campioni) è inferiore a 0,1 allora si può procedere con la metodica, in base alla quale, la quantità del nostro campione target, normalizzata al riferimento endogeno e relativa ad un calibratore, cioè ad un campione assunto come termine di paragone per risultati comparativi, è data dalla formula matematica:

- Standard curve method: Si costruisce una retta ponendo sull’asse delle ordinate il Ct e su quella delle ascisse il logaritmo delle concentrazioni relative di circa 6 diluizioni del campione.

Dopo aver calcolato l’equazione della retta, misuriamo la quantità iniziale del nostro target, sia del riferimento endogeno, mediante la formula matematica: 10^{log Ct-(b/m)}, dove b è l’intercetta all’origine della retta e m il suo coefficiente angolare. Effettuiamo il rapporto tra le due quantità e otteniamo la quantità normalizzata del gene target.

Dopodichè, scegliamo un calibratore ed esprimiamo le quantità normalizzate del gene target di ogni campione come differenze di n-volte rispetto al calibratore prescelto.

Come già detto, la Real Time fa uso di fluorocromi che emettono fluorescenza se eccitati da una determinata lunghezza d’onda.

Possono essere utilizzati, sia fluorocromi intercalanti (Etidio bromuro e Syber Green), sia sonde marcate con fluorocromi di tre possibili tipi:

- Sonde di ibridazione senza idrolisi (ad esempio Molecular Beacons, Fret probes)

Queste sono costituite da un oligonucleotide di 25-30 basi, marcato con fluorocromi alle due estremità:

Quando la sonda non è ibridata, il quencher assorbe la fluorescenza del reporter e il sistema è silente. Se il reporter si allontana dal quencher, si avrà l’emissione di una fluorescenza (Principio di Forster).

Ø Nella fase di denaturazione, tutta la fluorescenza del reporter è assorbita dal quencher.

Ø Nella fase di annealing, si appaiano primers e la sonda, ma anche in questo caso la fluorescenza è mascherata

Ø Nella fase di polimerizzazione, la Taq polimerasi, allungando i primers, degraderà la sonda ed allontanerà il quencher dal reporter; si osserverà la fluorescenza.

Tutto questo di ripete per ogni ciclo di PCR, con la conseguente produzione di un intenso segnale cumulativo di fluorescenza.

L’amplicone deve avere dimensioni di circa 70-150 pb, così che possa essere denaturato più facilmente ed amplificato in un tempo più breve.

Inoltre, le sonde devono avere una Melting Temperature di 68°-70°C, comunque maggiore di almeno 10°C rispetto a quella dei primers, se la Tm della sonda fosse uguale a quella dei primers, la sonda stessa potrebbe staccarsi prima ancora di essere raggiunta dalla Taq polimerasi.

Per questo motivo, le temperature di estensione devono essere subottimali. Infatti molti sistemi Taqman utilizzano solo due steps: denaturazione a 94°C e annealing ed estensione a 60°C.

Il contenuto relativo di DNA mitocondriale è stato quantificato mediante amplificazione in Real Time PCR del contenuto di mtDNA (amplificando una porzione del D-Loop) rapportata all’amplificazione del contenuto del DNA nucleare (nDNA) (amplificando il gene costitutivo della β-actina).

Per la Real Time PCR della regione del D-Loop sono stati usati i seguenti primers:

E’ stata inoltre utilizzata una sonda avente al 5’ il reporter 6FAM (6-carbossi fluoresceina) e al 3’ il quencher TAMRA (6-carbossi tetrametil rodamina) 3’:

Invece, il DNA nucleare è stato quantificato mediante amplificazione di una regione del gene della β-actina con primers e una sonda TaqMan marcata al 5’ con il reporter VIC e al 3’ con il quencher TAMRA:

40 ng di stampo di DNA totale di ciascun campione (in triplicato) sono stati utilizzati per effettuare la Real Time e preparati in 25 μl di volume finale contenenti 200 nM di ciascun primer, 100nM di sonde, TaqMan Universal Master Mix 1x (Applied Biosystems). Quest’ultima miscela MIX contiene:

- dNTPs con dUTP al posto di dTTP (ciò permette di ottenere prodotti di amplificazione contenenti uracile e non timina);

- l’enzima AmpErase Uracil-N-Glicosilasi (UNG) (elimina e previene l’amplificazione di sequenze contaminanti derivate da precedenti amplificazioni, agendo a livello dei residui di gracile);

- il fluorocromo ROX che funge da “passive reference”(costituisce un riferimento interno rispetto al quale normalizzare il segnale ottenuto, la normalizzazione è necessaria per correggere eventuali fluttuazioni causate da variazioni nella concentrazione o nel volume).

- 10 minuti a 95°C: per denaturare l’UNG e favorire la scissione di un anticorpo specifico inibente la Taq polimerasi per permetterne l’attivazione

- 40 cicli, costituiti da 15 secondi di denaturazione a 95°C e da una fase di appaiamento ed estensione di 1 minuto a 60°C.

Durante la reazione, il computer e il programma collegato misura la fluorescenza emessa, che è proporzionale alla quantità di prodotto amplificato.

La rilevazione è stata effettuat usando l’ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystem). L’analisi statistica dei risultati è stata condotta mediante test ANOVA, eseguito usando il software SSPS BASE 11.5.

L’avvenuta amplificazione può essere visualizzata tramite elettroforesi su gel d’agarosio 2.5% in tampone TAE 1X, osservando la presenza di frammenti unici di PCR delle dimensioni attese.

[7] y = quantità di DNA (post-PCR); x = quantità di DNA target (pre-PCR); E = efficienza di amplificazione; n = numero di cicli

[8] Naturalmente, ogni fluorocromo avrà bisogno di un filtro che valuta la fluorescenza alla propria lunghezza d’onda.

[9] Generalmente, ci conviene fare un triplicato sia degli standard, sia degli unknown per poi farne una media, poiché ci possono essere degli errori di pipettamento con conseguenti errori nell’amplificato

Il DNA genomico totale (mitocondriale e nucleare) è stato estratto dai campioni dei 2 muscoli Soleo ed EDL di ratti di 6 e 28 mesi di età e di ratti di 28 mesi trattati con ALCAR per 1 mese, 2 mesi e due mesi seguiti da 1 mese di sospensione della somministrazione.

Tutti i ratti, invecchiati e/o trattati, avevano 28 mesi al momento del sacrificio.

In figura 21 è riportato un esempio di DNA genomico totale estratto e caricato su un gel d’agarosio 0,8% di TAE 1X.

Il contenuto relativo di mtDNA (misurato come rapporto mtDNA/nDNA) nei 2 muscoli Soleo ed EDL di ratti di 6 e 28 mesi di età e di ratti di 28 mesi trattati con ALCAR per 1 mese, 2 mesi e due mesi seguiti da 1 mese di sospensione della somministrazione, è stato quantificato mediante una applicazione della Real Time PCR messa a punto nel laboratorio dove ho svolto il tirocinio.

Sono stati usati primer specifici e sonde TaqMan (Applied Biosystems) per la regione mitocondriale del D-Loop e per il gene nucleare della b-actina opportunamente disegnati usando il software Primer Express (Applied Biosystems). Le sonde sono state marcate con due fluorofori: il reporter, all'estremità 5' e il quencher, all'estremità 3'. La sonda per la b-actina e quella per il D-loop sono state marcate al 5', rispettivamente, con il reporter VIC e con il reporter FAM (6-carbossifluoresceina) mentre entrambe al 3' sono state marcate con il quencher TAMRA (6-carbossi tetrametil rodamina).

Il metodo di quantificazione utiliazzato è stato quello del “Comparative Ct method”, la cui applicazione è stata possibile dopo aver verificato che le efficienze di amplificazione del D-Loop e del gene per la β-actina fossero paragonabili.

Nel test di validazione (Figura 22) sono state allestite amplificazioni utilizzando diluizioni seriali di un campione rappresentativo.

In figura 23 sono stati riportati i valori di Ct in funzione del logaritmo delle diluizioni usate per il target mitocondriale (D-Loop) e per la β-actina.

Riportando i valori di DCt in funzione del logaritmo della diluizione, è stata ottenuta una retta il cui coefficiente angolare essendo minore di 0,1 indica che il test di validazione della paragonabilità delle efficienze di amplificazione degli ampliconi presi in esame è stato superato.

Ogni campione è stato analizzato in triplicato e gli spettri di fluorescenza sono stati analizzati mediante l'ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystem). Il numero del ciclo-soglia (Ct), è stato usato come misura della quantità di DNA bersaglio e per determinare il livello relativo del mtDNA (D-loop) rispetto al gene riferimento (b-actina), mediante la seguente equazione R= 2^-^DCt dove R è il rapporto calcolato e DCt è il valore della differenza Ct(D-loop)–Ct(b-actina).

In figura 24 è riportato un esempio rappresentativo di un esperimento di Real Time PCR.

In figura 25 è mostrato un esempio rappresentativo del risultato di una corsa elettroforetica su gel d’agarosio al 2,5% in TAE 1X dei prodotti di amplificazione del D-Loop e della β-actina (94 e 91pb). M = Marker 100pb Ladder.

La bande delle dimensioni attese ed uniche sono indice di specificità dell’allestimento delle Real Time PCR.

I risultati dell'analisi quantitativa sono stati sottoposti ad analisi statistica mediante il test ANOVA, per individuare differenze statisticamente significative con un intervallo di confidenza maggiore del 95% (p < 0,05) e sono mostrati nell'istogramma in Figura 26.

Figura 26 Effetto della somministrazione di ALCAR sul contenuto di mtDNA nei muscoli Soleo ed EDL di ratti invecchiati. Per ciascun gruppo sono stati analizzati 7 animali. ANOVA

Il contenuto relativo di mtDNA nel muscolo Soleo diminuisce durante l’invecchiamento fino a raggiungere, a 28 mesi, una diminuzione statisticamente significativa del 50% (* p<0,05) rispetto ai ratti di 6 mesi.

Nel muscolo EDL (Figura 26) non ci sono variazioni statisticamente significative riguardanti il contenuto relativo di mtDNA. Questi dati sono in accordo con i dati precedentemente riportati da Pesce et al. (2005)

La somministrazione di ALCAR evidenzia nel muscolo Soleo (Figura 26) un contenuto più elevato di mtDNA statisticamente significativo (p<0,05), pari al 22% dopo 1 mese di trattamento ed al 15% dopo 2 mesi di trattamento. Dopo 2 mesi di somministrazione di ALCAR ed 1 mese di interruzione della stessa , il valore del livello di mtDNA è uguale al valore dei ratti di 28 mesi di partenza.

Nel muscolo EDL, il trattamento fino a 2 mesi con ALCAR mostra un contenuto di mtDNA più alto rispetto al controllo ma il cui valore non raggiunge la significatività statistica.

I risultati qui riportati possono essere interpretati alla luce del diverso contenuto in fibre di tipo I e II dei due muscoli analizzati, ossia Soleo ed EDL, del loro diverso contenuto in mitocondri e del diverso ruolo funzionale dei muscoli stessi. Il Soleo è infatti un muscolo posturale e quindi è normale che sia quello che più risente della relativa inattività del ratto vecchio. I diminuiti stimoli che arrivano al Soleo del ratto vecchio e “sedentario” fanno perdere a tale muscolo mitocondri e quindi DNA mitocondriale, perdita che può essere parzialmente prevenuta dalla somministrazione di ALCAR.

L’ALCAR probabilmente agirebbe attraverso una via di segnalazione simile a quella che porta alla biogenesi mitocondriale attivata dall’esercizio fisico e dalla stimolazione elettrica (Williams 1986; Williams et al., 1987). Infatti, è stato già dimostrato l’aumento della proteina TFAM nel muscolo Soleo di ratti di 28 mesi di età trattati per 2 mesi con ALCAR (Pesce et al. 2004) ed inoltre è stato evidenziato l’aumento dei trascritti mitocondriali COXI e 16S nel muscolo Soleo trattato con ALCAR per due mesi (Pesce V. comunicazione personale)

I nostri risultati non evidenziano, nel muscolo EDL, l’aumento di mtDNA registrato nel Soleo degli stessi animali, nonostante nell’EDL sia stato riportato un aumento di TFAM come proteina (Pesce et al 2004). D’altra parte, stando ai dati qui riportati l’EDL non sembra subire la perdita di mtDNA con l’aumento dell’età. Poiché l’EDL è un muscolo povero di mitocondri, probabilmente l’incremento di TFAM nelle fibre di tipo II, indotto dall’ALCAR, non è sufficiente ad indurre la replicazione di mtDNA. Analisi più approfondite dovranno essere condotte a livello di singola fibra e usando quantità diverse di ALCAR.

I risultati ottenuti dal trattamento con ALCAR sul contenuto di mtDNA nel Soleo di ratto vecchio così come quelli già riportati per TFAM evidenziano il fatto che, per ottenere effetti benefici dalla somministrazione di ALCAR nel ratto vecchio, è necessaria una somministrazione continua del farmaco stesso. L’ALCAR si comporta cioè come un “nutraceutical”: bisogna che all’animale vecchio tale sostanza sia somministrata quotidianamente.

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