Università degli Studi di Milano
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Scienze Biologiche
“Utilizzo di costrutti GFP per lo screening di farmaci antitumorali inducenti apoptosi”
Relatore: dott.ssa P. Sacerdote
Correlatore: dott.ssa M. Muzio
Ente presso cui è stato svolto lo stage:
Nerviano Medical Sciences Srl, viale L. Pasteur 10
20014 - Nerviano (Milano)
A.A. 2004-2005
RIASSUNTO
Una cellula tumorale perde il controllo della proliferazione cellulare in quanto sono danneggiati o addirittura mancanti alcuni dei checkpoint che regolano il ciclo cellulare. Le neoplasie infatti sono caratterizzate da un aumento della massa cellulare dovuto ad un'incontrollata proliferazione cellulare. L'obbiettivo della farmacologia oncologica è quello di trovare molecole in grado di bloccare il ciclo cellulare e attivare l’apoptosi o morte cellulare programmata.
L'obbiettivo di questo progetto è quello di creare e caratterizzare una linea cellulare trasfettata con un costrutto che permette di seguire l’induzione di apoptosi dopo trattamento farmacologico. Le Caspasi sono enzimi appartenenti alla famiglia delle cysteine–aspartic acid proteases ovvero proteine che tagliano i residui di aspartato nei diversi substrati. In particolare la Caspasi-3 ha un ruolo di esecuzione nel programma apoptotico cellulare in quanto è responsabile dell’attività proteolitica che esercita sui vari substrati ed è quindi utilizzata come marker per l’apoptosi.
Il vettore plasmidico pCaspase3-Sensor Vector è stato usato per monitorare l'attività della Caspasi-3. Questo costrutto codifica per la EYFP (Enhanced Yellow-green Fluorescent Protein) fusa alla sua estremità 5' con una sequenza della proteina PARP (Poli ADP-Ribosio Polimerasi) contenente il sito di taglio riconosciuto dalla Caspasi-3. In 5’ rispetto al sito di taglio c’è un NES (Nuclear Export Signal), mentre all’estremità 3’ adiacente alla sequenza EYFP è posto un NLS (Nuclear Localization Signal).
In cellule proliferanti la proteina fluorescente EYFP è distribuita nel citoplasma. Quando le cellule muoiono per apoptosi, e la Caspasi-3 è attivata, la proteina di fusione EYFP viene tagliata e trasloca nel nucleo per mezzo del NLS.
Grazie alla microscopia a fluorescenza è possibile monitorare in tempo reale la localizzazione e la traslocazione della EYFP ed è possibile determinare velocemente l'induzione dell'apoptosi nelle singole cellule.
Gli strumenti impiegati per questa analisi sono l'ArrayScan™ (Cellomics) ed i microscopi a fluorescenza "time-lapse". Per il trattamento farmacologico delle cellule si è impiegata la stazione automatizzata Biomek 2000 (Beckman Coulter) grazie alla quale le operazioni di pipettamento, diluizione e dispensazione sono effettuate velocemente e garantiscono la standardizzazione degli esperimenti. Con lo stesso strumento possono essere effettuate anche l’immunostaining delle cellule e la loro fissazione.
In conclusione, è stata creata una nuova linea cellulare contenente un costrutto fluorescente utile per lo screening cellulare automatizzato di nuovi farmaci antitumorali.
L’apoptosi o morte cellulare programmata è un processo fisiologico importante atto a mantenere l’omeostasi della cellula, dei tessuti e dell’organismo intero. Studi di biologia dello sviluppo hanno sottolineato l’importanza di questo processo: infatti durante l’ontogenesi interi tessuti che risulterebbero funzionalmente inutili per l’animale adulto vengono rimossi proprio attraverso il programma di morte cellulare, così come la formazione del sistema immunitario prevede l’attivazione dell’apoptosi in quelle cellule che non possiedono i requisiti funzionali. L’apoptosi si svolge grazie a un programma genetico conservato in modo simile dai nematode (C. elegans) fino all’uomo e questo ne sottolinea ulteriormente la sua importanza.
Sulla base degli studi condotti sia sui nematode che sui vertebrati, è possibile suddividere i geni coinvolti in questo fenomeno in categorie funzionali diverse:
1) geni della competenza: p53; c-myc; Fas; Ras; pRb
2) geni regolatori della morte: famiglia di Bcl-2; Bax; Bcl-XL
3) geni esecutori del programma: caspasi (Caspasi-3)
4) geni della fagocitosi: recettore della fosfatidilserina
Stimoli di diversa natura (come radiazioni, farmaci, citochine) sono in grado di innescare il programma apoptotico preferenzialmente in cellule in attiva divisione per cui, grazie anche a diverse tecniche di analisi cellulare e molecolare, si è potuta constatare l’esistenza di un rapporto tra apoptosi e ciclo cellulare. La tabella 1.1 riassume i principali eventi che si manifestano durante l’apoptosi. La figura 1.1 mostra uno schema dei processi che avvengono durante l’apoptosi.
CAMBIAMENTI MORFOLOGICI |
CAMBIAMENTI BIOCHIMICI |
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Condensazione del citoplasma |
Condensazione e frammentazione del DNA |
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Indebolimento e ispessimento dei mitocondri |
Rilascio nel citoplasma del citocromo C |
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Blebbing della membrana cellulare
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Attivazione della cascata delle caspasi |
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Formazione di corpi apoptotici
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Esposizione fosfatidilserina |
Le Caspasi sono enzimi appartenenti alla famiglia delle cysteine–aspartic acid proteases ovvero proteine che tagliano i residui di aspartato nei diversi substrati.
La Caspasi-3 ha un ruolo di esecuzione nel programma apoptotico cellulare in quanto è responsabile dell’attività proteolitica che esercita sui vari substrati.
Il gene della Caspasi-3 codifica per una cistein-proteasi di 32 kDa, composta da 277 aminoacidi originariamente denominata CPP32, Yama, Apopaina ed è un membro della subfamiglia di caspasi CED-3 (l’omologo del nematode C. elegans).
La proteina si presenta in due forme: una forma inattiva e una attiva. La forma inattiva è un proenzima, è localizzata nel citoplasma e presenta un peptide (o prodominio, PRO) all’estremità N-terminale. Per passare alla forma attiva, la proteina viene tagliata sui residui di aspartato (IETD-S) tra PRO e p17 e tra p17 e p12 che divide la proteina in due subunità, una piccola di 12 kDa (p12) e una più grande di 17 kDa (p17) come mostrato in figura 1.2.
Figura 1.2 La Caspasi-3 è una proteina che nella forma inattiva è composta da 277 aminoacidi ed è costituita da un prodominio (PRO), una subunità maggiore di 17 kDa (p17), una subunità minore di 12 kDa (p12) e un sito di taglio tra le due subunità per mezzo del quale la caspasi-3 diventa attiva.
Durante l’apoptosi la Caspasi-3 è responsabile dell’attività proteolitica a carico di un gran numero di substrati ognuno dei quali contiene una determinata sequenza. In particolare la Caspasi-3 predilige quei substrati che presentano una sequenza tipo DXXD (dove X può essere un aminoacido come Valina o Aspartato); per esempio la proteina substrato PARP (poly-ADP-ribose polymerase), un enzima preposto alla riparazione del DNA, presenta un sito di taglio DEVD-G.
MATERIALI E METODI:
“BD Clontech ApoAlert™ pCaspase3-Sensor Vector” è un vettore plasmidico in grado di monitorare l’attività della Caspasi-3 e quindi di individuare l’induzione di apoptosi nelle singole cellule. La mappa del vettore è mostrata in figura A.
La proteina Caspase3-Sensor contiene all’estremità N-terminale una sequenza dominante NES (segnale di esportazione nucleare); un sito di taglio ottimizzato per la Caspasi-3; BD Living Colors™ Enhanced Yellow-green Fluorescent Protein (EYFP) e una sequenza NLS (segnale di localizzazione nucleare) all’estremità C-terminale.
Quando la Caspasi-3 non è attiva, la sequenza NES indirizza la proteina EYFP nel citoplasma, mentre quando è attiva, la Caspasi-3 taglia via la sequenza NES e la EYFP rimane legata alla sequenza NLS per cui viene localizzata nel nucleo. La traslocazione di questa proteina (EYFP) viene monitorata utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Nella figura B. è mostrato uno schema della struttura della sequenza proteica in esame.
Il vettore codifica per la EYFP (enhanced yellow-green fluorescent protein), una variante della Green Fluorescent Protein (GFP) dell’Aequorea victoria, fusa all’estremità 3’ con tre copie del segnale per la localizzazione nucleare (NLS). All’estremità 5’ il gene contiene una sequenza che codifica per il segnale di esportazione nucleare (NES) della Map Kinase Kinase (MAPKK). La sequenza NES è separata dalla regione che codifica per la EYFP da una sequenza di 36 nucleotidi che codifica la regione di PARP tagliata dalla Caspasi-3.
La sequenza NES della MAPKK è dominante rispetto alla NLS e la proteina di fusione fluorescente “full-length” è distribuita nel citoplasma. Quando la Caspasi-3 è attivata, la sequenza NES viene tagliata e si stacca dalla proteina di fusione (EYFP-NLS) la quale trasloca nel nucleo grazie alla sequenza NLS. La traslocazione della proteina fluorescente dal citoplasma al nucleo è indice dell’attività della Caspasi-3.
La proteina EYFP ha un picco di eccitazione massimo a 513 nm ed emette la tipica fluorescenza giallo-verde a 527 nm.
Il plasmide presenta una sequenza (Neor) che codifica per il gene che conferisce resistenza alla neomicina (antibiotico per i funghi e microrganismi eucarioti). Questa sequenza assicura l'espressione del gene neomicina fosfotrasferasi nelle cellule di mammifero rendendole resistenti all'antibiotico G418 (geneticina), permettendo così l'isolamento e la selezione dei cloni trasfettati stabilmente.
La figura C. mostra uno schema della traslocazione della EYFP prima in cellule che non sono apoptotiche e che quindi hanno la Caspasi-3 nella forma inattiva (A), poi in cellule apoptotiche le quali presentano le Caspasi-3 attivate che tagliano la sequenza NES della EYFP che trasloca così nel nucleo.
Linea Cellulare
U2OS è una linea cellulare trasformata proveniente dal tessuto osseo affetto da osteosarcoma. Queste cellule sono state scelte in quanto hanno alti livelli di espressione della Caspasi-3 e si presentano con una morfologia simile ad un epitelio adatta per lo studio in microscopia. Crescono come monostrato utilizzando come terreno di coltura McCoy’s 5A (GIBCO) + 10% FBS (siero bovino fetale) decomplementato. Il tempo di duplicazione è di 24 ore e l’incubazione avviene a 37°C con 5% CO2. Le cellule vengono passate due volte alla settimana con tripsina (Tripsina – EDTA 3%, Sigma).
Per eseguire la trasfezione delle cellule U2OS ed ottenere cloni stabili EYFP occorre digerire il plasmide con un enzima di restrizione (ApaL I) che taglia il DNA in un sito non necessario per l’espressione in cellule di mammifero (pUC ori). Dopo aver fatto correre il DNA digerito in un gel di agarosio (al 10 %) si procede con l’estrazione di questo DNA dal gel attenendosi al protocollo QIAquick Gel Extration Kit (QIAGEN®). Si esegue poi un’elettrporazione (con BioRad Gene Pulser® II) a 380 V e 950 mF. Le cellule trasfettate vengono poi selezionate tramite trattamento con l’antibiotico geneticina (G418).
Per osservare la traslocazione della proteina EYFP dal citoplasma al nucleo in tempo reale, si utilizza il Time Lapse (Cell-Observer ZEISS), uno speciale microscopio che permette di osservare le cellule sia in trasmissione che in fluorescenza. È possibile osservare cellule vive anche per tempi lunghi perchè le piastre poggiano su un porta-oggetti che mantiene costante la temperatura, la CO2 e di conseguenza il pH. Grazie a questo strumento è possibile studiare particolari fenomeni come la motilità, la cititossicità, la morfologia e il ciclo cellulare.
Per gli esperimenti vengono utilizzati obiettivi 20x e 32x.
Le cellule trasfettate stabilmente vengono lisate e seguendo l’apposita procedura si ottiene l’estratto proteico sul quale si esegue un dosaggio tramite lettura allo spettrofotometro (595 nm).
Si procede quindi all’analisi eseguendo un western blot delle proteine cellulari ottenute. Le proteine vengono fatte correre su un gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) al 12 % insieme ad un marker (RPN 800). Terminata la corsa il gel viene trasferito su una membrana di nitrocellulosa e si procede con l’incubazione tramite anticorpi primari e secondari per rilevare la presenza delle proteine di interesse come PARP, Caspasi-3 attiva, EYFP.
Dopo lo sviluppo delle lastre è possibile visualizzare alcune bande ad un determinato peso molecolare, in base al marker di riferimento e quindi constatare l’azione delle Caspasi-3.
Immunostaining:
Per il trattamento delle cellule U2OS-CSV YFP (U2OS-Caspase Sensor Vector Yellow Fluorescent Protein) è stata impiegata la stazione automatizzata Biomek 2000 (Beckman Coulter) grazie alla quale le operazioni di pipettamento, dispensazione, lavaggio e diluizione sono effettuate in modo veloce e ripetibile in modo da garantire la standardizzazione degli esperimenti. Con questo strumento sono stati eseguiti immunostaining utilizzando gli anticorpi diretti contro p53 e phHIS-H2A.
Dopo aver trattato le piastre contenenti le cellule con alcuni farmaci inducenti apoptosi, queste vengono lette e analizzate dall’ArrayScan™ (Cellomics) per mezzo del quale è possibile rilevare diversi parametri come il numero di cellule, l’intensità di fluorescenza sia nucleare che citoplasmatica, la morfologia cellulare e la possibilità di quantificare il processo di traslocazione della proteina EYFP. In questo modo è possibile validare l’efficacia delle diverse molecole nell’induzione di apoptosi nella linea cellulare trasfettata U2OS-CSV YFP.
RISULTATI
Le cellule U2OS sono state trasfettate con il vettore pCaspase3-Sensor Vector.
Abbiamo creato un clone stabile tagliando il plasmide CSV con l’enzima di restrizione ApaL I. Dopo che è avvenuta la digestione, il DNA è stato fatto correre su gel di agarosio.
Il DNA è stato poi estratto e utilizzato per trasfettare tramite elettroporazione le cellule U2OS. Dopo la selezione delle cellule che hanno incorporato il plasmide si è potuto osservare al microscopio a fluorescenza la presenza di cloni stabili (figura 1).
Per facilitare l’operazione di clonaggio, il clone stabile viene ampliato e sottoposto a sorting utilizzando il FACS (Fluorescence Active Cell System). La figura 2 mostra i risultati ottenuti dall’analisi citofluorimetrica e con il microscopio a fluorescenza è stato possibile selezionare i cloni con una fluorescenza più intensa.
È stata misurata la crescita cellulare della popolazione di U2OS-CSV YFP ed è stata paragonata a quella delle U2OS normali. È stato inoltre effettuato un test per controllare un’eventuale contaminazione da micoplasma.
Come è possibile notare dalle figure, il tempo di duplicazione è pressochè simile, leggermente maggiore per quanto riguarda il clone trasfettato (figure 3a e 3b).
Trattamenti:
Le cellule U2OS-CSV YFP sono state trattate con alcuni composti inducenti apoptosi quali:
Camptotecina (CPT): inibitore delle topoisomerasi I e II
Brostallicina: intercalante del DNA
Vincristina: inibitore della polimerizzazione della tubulina
Staurosporina: inibitore delle protein-kinasi
Leptomicina B: acido grasso insaturo che non induce apoptosi e inibisce l’attività dell’esportina-1 (CRM-1)
Taxolo: inibitore della depolimerizzazione dei microtubuli
VP 16: inibitore della topoisomerasi II
I tempi e le dosi impiegate nei trattamenti sono riportati nelle figure.
La Leptomicina B inibisce l’attività di esportazione di CRM-1 legandosi covalentemente al residuo di Cys528 e prevenendo il legame di CRM-1 col substrato dopo solo 3 minuti dal trattamento.
La EYFP presenta sia la sequenza NES che quella NLS per cui è soggetta ad una continua traslocazione dal citoplasma al nucleo e viceversa ma essendo la sequenza NES dominante, la EYFP è presente prevalentemente nel citoplasma.
Trattando le cellule con Leptomicina B, questa si lega covalentemente al complesso CRM-1 causando un blocco dell’esportazione del materiale nucleare. Infatti una volta che la EYFP è entrata nel nucleo, questa non viene più esportata (pur preservando ancora le sequenza NES) e di conseguenza si può notare visibilmente un aumento della fluorescenza nucleare fino a saturazione, senza diminuzione di quella citoplasmatica e questo non comporta alcun processo apoptotico (figura 4).
Le cellule trattate con Staurosporina seguono il tipico processo apoptotico. Nella figura 5 si può notare come la fluorescenza diventi da citoplasmatica a nucleare in conseguenza della traslocazione della EYFP dovuta all’azione delle Caspasi-3. Nelle foto a trasmissione è possibile notare i caratteristici cambiamenti morfologici delle cellule apoptotiche.
In base all’analisi dei dati ottenuti dalle cellule trattate con Staurosporina e Leptomicina B si può verificare che la traslocazione è un evento dipendente da CRM-1, difatti le cellule trattate con Leptomicina B presentano un aumento della fluorescenza nucleare ma il numero di cellule rimane costante mentre nel caso delle cellule trattate con Staurosporina aumenta la fluorescenza nucleare ma parallelamente il numero di cellule diminiusce perchè vanno incontro ad apoptosi. La vitalità delle cellule è ottenuta mediante colorazione dei nuclei con il DRAQ5, un colorante vitale e analizzate con l’ArrayScan™ (figure 6, 7 e 8).
Parallelamente al Time Lapse è stato effettuato un Western Blot per validare ulteriormente i risultati ottenuti.
Le bande della figura 9 si riferiscono alla proteina EYFP full lenght cioè che presenta le tipiche regioni NES, NLS e DEVD nonchè appunto la regione EYFP. Nel controllo è presente una sola banda mentre nelle cellule trattate con Staurosporina (A, B, C) si può notare una seconda banda più piccola al di sotto della prima che corrisponde alla YFP tagliata dall’azione delle Caspasi-3. Le cellule trattate con Leptomicina B (D) invece, appaiono come il controllo difatti presentano solo la banda YFP full lenght.
Grazie a questa linea cellulare è possibile eseguire uno screening di farmaci che inducono apoptosi e tramite analisi all’ArrayScan™ è possibile valutare diversi parametri tra cui:
L’intensità nucleare:
misura la percentuale di cellule che presentano una fluorescenza nucleare al di sopra di una certa soglia. Questa analisi è stata effettuata sia direttamente misurando la fluorescenza intrinseca delle U2OS-CSV YFP dovuta al costutto trasfettato, che indirettamente utlizzando l’anticorpo contro la forma attiva delle Caspasi-3. Entrambi i dati esprimono i medesimi valori (figura 10), infatti Brostallicina e Vincristina sono dei potenti apoptotici e aumentano l’intensità della fluorescenza nucleare mentre la CPT non è un farmaco efficace nell’indurre apoptosi.
La percentuale di nuclei condensati/frammentati:
misura l’intensità di fluorescenza all’interno dei nuclei delle cellule e la loro grandezza, tipicamente infatti le cellule apoptotiche appaiono con un nucleo fluorescente e una dimensione più piccola rispetto a quelle vitali. Con questo algoritmo si può analizzare anche la percentuale di cellule che presentano un nucleo frammentato, uno degli ultimi stadi del processo apoptotico e questa analisi è stata eseguita in base all’intensità della fluorescenza nucleare e dell’aspetto morfologico ad essa correlato. (Risultati non mostrati).
Con le U2OS-CSV YFP è stato eseguito un time-course per analizzare alcuni markers di apoptosi come:
- numero cellulare
- phHis H2A
- p53 totale
- Caspasi-3 attive
a tempi diversi (90 minuti, 4 ore, 12 ore e 24 ore) in seguito a trattamento con farmaci quali: Staurosporina, Taxolo, VP 16 e Camptotecina (CPT).
La conta cellulare:
misura il numero di cellule vive presenti in una popolazione trattata con farmaci e riferita ad una popolazione di controllo con solo terreno di coltura. La conta viene eseguita tramite rilevazione dei nuclei previa colorazione con DRAQ5. E’ possibile notare come con la Brostallicina e la Vincristina il numero di cellule si abbassi mentre non si nota alcuna diminuzione dovuta alla Camptotecina (figura 11a).
p53 totale:
p53 è una proteina importante che interviene nella soppressione dei tumori e nei meccanismi di riparazione cellulare. È un checkpoint fondamentale perchè in base all’entità del danno può scegliere se far sopravvivere o morire la cellula. p53 è presente nel nucleo e quando viene attivata per mezzo di un trattamento farmacologico, aumenta la sua quantità e stabilità quindi è possibile misurare l’intensità di fluorescenza all’interno del nucleo. Già a 90 minuti è possibile osservare un aumento dell’attività di p53 in risposta all’azione della Staurosporina (risultati non mostrati) e questa attività si mantiene pressochè costante fino alle 24 ore. La CPT e il VP 16 esprimono la loro azione intorno alle 12 ore mentre il Taxolo non influisce molto sulla p53 totale (figura 11c).
Caspasi-3:
utilizzando l’anticorpo Anti Active Caspase-3 (Promega) si è misurata la concentrazione di Caspasi-3 nella cellula e si può osservare che Staurosporina e Taxolo aumentano la quantità di Caspasi-3 attiva difatti sono potenti induttori di apoptosi (figura 11d).
CONCLUSIONI
La linea cellulare U2OS-CSV YFP può essere utile nello screening dei farmaci antitumorali in quanto presenta alcuni vantaggi tra cui:
Le cellule non si staccano anche dopo ripetuti lavaggi:
la linea cellulare U2OS-CSV YFP presenta una buona capacità di adesione alla piastra e grazie a questa sua caratteristica è possibile effettuare diversi lavaggi senza perdere un numero elevato di cellule, in particolare in piastre ricoperte da poli-L-lisina.
La possibilità di individuare i diversi stadi dell’apoptosi:
grazie alle analisi effettuate con l’ArrayScan™ (Cellomics) è possibile individuare la cronologia di alcuni passaggi che si susseguono durante l’apoptosi, tra cui l’attivazione delle Caspasi, la condensazione nucleare, la frammentazione nucleare e la tipica morfologia cellulare che decreta la fine del processo apoptotico preparando la cellula ad essere fagocitata in vivo dalle cellule vicine e dalle cellule del sistema immunitario.
Possibilità di analizzare altri marker dopo la fissazione nella stessa piastra:
grazie a questa linea cellulare è possibile eseguire più di un immunostaining per poter studiare così i target inibiti da un farmaco.
Guadagno in termini di tempo e costi rispetto allo staining con anticorpi:
la possibilità di analizzare e studiare diversi marker su di una stessa linea cellulare e l’utilizzo di strumenti ad alta tecnologia come l’ArrayScan™ (Cellomics) e il Biomek 2000 (Beckman Coulter) permettono di incrementare la mole di dati a disposizione con un risparmio sia in termini economici che in termini di tempo.
FIGURE
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Bibliografia
1 Gerald M. COHEN (1997) Rev. Biochem J. 326, 1-16
2 R. Paoletti, S. Nicosia, F. Clementi, G. Fumagalli (1999) Farmacologia generale e molecolare 322-326
3 BD Biosciences Clontech * www.bdbiosciences.com
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